Navržení peptidů

Při výběru peptidů pro vlastní syntézu je třeba během procesu návrhu zvážit několik důležitých faktorů. Mezi tyto faktory patří délka sekvence, rozpustnost a stabilita sekvence.  

Délka sekvence

Čistota peptidu obvykle klesá s rostoucí délkou sekvence.  Zvláštní pozornost věnujte sekvencím delším než 30 aminokyselin. Větší délka se rovná většímu počtu aminokyselinových spojek, což může mít za následek problémy s rozpustností při purifikaci při pokusu o odstranění nečistot ze syntézy.

Rozpustnost peptidů

Aminokyseliny jsou klasifikovány podle indexu hydropatie na základě hydrofobních nebo hydrofilních vlastností jejich postranních řetězců. Zařazení nebo vyloučení hydrofobních nebo hydrofilních aminokyselin v peptidové sekvenci ovlivní schopnost syntetizovat, čistit a rozpouštět konečný peptidový materiál ve vodných roztocích.

Klasifikace aminokyselin:

Hydrofobní (nepolární): Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val

Nenabité (polární): Asn, Cys, Gly, Gln, Pro, Ser, Thr, Tyr

Acidic (polar): Asp, Glu

Basic (polar): Při fyziologickém pH budou Asp, Glu, Lys a Arg obsahovat nabité postranní řetězce.[  Při fyziologickém pH budou Asp, Glu, Lys a Arg obsahovat nabité postranní řetězce.[  Při fyziologickém pH budou His, Lys, Arg

TIP: Udržujte obsah hydrofobních aminokyselin pod 50 % celkové délky sekvence a zahrňte alespoň jednu nabitou aminokyselinu na každých pět aminokyselin. Jediná konzervativní záměna, například nahrazení Ala za Gly nebo přidání polárních aminokyselin na N- nebo C-konec, může zlepšit rozpustnost.

Stabilita sekvence peptidů

Existuje několik strategií pro zlepšení stability peptidů, které povedou k vyšší čistotě a optimální rozpustnosti. Aminokyselinové složení peptidové sekvence ovlivňuje celkovou stabilitu a je třeba zvážit následující scénáře:

1. Více aminokyselin Cys, Met nebo Trp může být obtížné získat ve vysoké čistotě, částečně kvůli náchylnosti k oxidaci a/nebo bočním reakcím.

TIP: Vyberte sekvence, které tyto zbytky minimalizují, nebo zvolte konzervativní náhrady těchto aminokyselin.  Norleucin může nahradit Met a Ser může být méně reaktivní náhradou za Cys.  Pokud se navrhují překrývající se peptidy z bílkovinné sekvence, posunutím počátečního bodu každého peptidu lze také vytvořit lepší rovnováhu mezi hydrofobními a hydrofilními zbytky aminokyselin.

2. V případě, že se peptidy z bílkovinné sekvence překrývají, je možné je nahradit méně reaktivními zbytky. N-koncový Gln (Q) je nestabilní a při vystavení kyselým podmínkám štěpení může cyklizovat na pyroglutamát.

TIP: Změňte N-konec sekvence nebo tuto aminokyselinu nahraďte.

3. Asparagin (N) má ochrannou skupinu, která se obtížně odstraňuje, pokud je umístěna na N-konci peptidové sekvence.

TIP: Odstraňte Asn na tomto místě, nahraďte ji jinou aminokyselinou nebo prodloužte peptid o jeden aminokyselinový zbytek.

4. Více prolinů (P) nebo sousedních serinů (S)  v sekvenci může mít za následek produkt, který má nižší čistotu nebo obsahuje mnoho delečních produktů. Více prolinů může také podléhat cis/trans izomerizaci, což má za následek produkt se zjevně nižší čistotou.

5. V případě, že je produkt více prolinů, může být jeho čistota nižší. Tvorba beta listů představuje problém, protože způsobuje neúplnou solvataci rostoucího peptidového řetězce a bude mít za následek vyšší výskyt delečních sekvencí v konečném produktu. 

TIP: Vyhněte se sekvencím, které obsahují více nebo sousedící Val, Ile, Tyr, Phe, Trp, Leu, Gln a Thr. Rozbijte vzor konzervativními záměnami, například vložením Gly nebo Pro na každý třetí zbytek, nahrazením Gln za Asn nebo nahrazením Thr za Ser.