Pryskyřice ChemMatrix^® pro syntézu peptidů v pevné fázi

Matthias Junkers

Product Manager

Volume 11 Article 1

matthias.junkers@sial.com

ChemMatrix^® je patentovaná pryskyřice na bázi 100% PEG (polyethylenglykolu) od společnosti PCAS BioMatrix. Kombinuje silné stránky dvou hlavních pryskyřičných systémů - chemickou stabilitu polystyrenových pryskyřic a vynikající výkonnost pryskyřic roubovaných PEG, což z ní činí nejlepší volbu pro syntézu velkých nebo hydrofobních peptidů a dokonce i proteinů na pevné podložce.

V posledních desetiletích byly polystyrenové pryskyřice hlavní volbou pro syntézu peptidů na pevné podložce díky svým dobrým výsledkům při syntéze malých peptidů. Nicméně s rostoucím řetězcem aminokyselin během syntézy se zvyšuje tendence peptidu vytvářet sekundární struktury. Hydrofobní prostředí polystyrenové pryskyřice zesiluje agregační chování peptidu, což činí syntézu velkých peptidů velmi obtížnou nebo dokonce nemožnou. Surové produkty velkých peptidů syntetizovaných na polystyrenových pryskyřicích vykazují směs delečních sekvencí a nekompletních fragmentů. PEG roubované pryskyřice pomohly dosáhnout lepší čistoty surových peptidů tím, že se pryskyřice stala polárnější a zlepšily se její bobtnavé vlastnosti v polárních i nepolárních rozpouštědlech. Nevýhodou je, že tyto pryskyřice roubované PEG umožňují pouze menší zatížení a jsou méně chemicky stabilní, což vede k možnému vyluhování během kroku štěpení.

Pryskyřice ChemMatrix^® byla navržena od nuly, počínaje novým typem monomerního stavebního bloku. Výsledná polymerní pryskyřice je postavena výhradně na primárních éterových vazbách, a proto vykazuje vysokou chemickou stabilitu, čímž se zamezuje vyluhování (obrázek 1).¹

Obrázek 1. Starý lesk Aminomethyl-ChemMatrix^® pryskyřice je kompletně postaven na chemicky stabilních polyetherových vazbách (vlevo). Mikroskopický snímek kuliček ChemMatrix^® (vpravo).

Zvýšená polarita pryskyřice zároveň umožňuje použití různých polárních rozpouštědel, včetně vody, THF, DMF, methanolu a acetonitrilu, v nichž pryskyřice vykazuje vynikající bobtnací vlastnosti (obrázek 2). Při praktickém použití je třeba vzít v úvahu vysoké bobtnací vlastnosti, protože vlhká pryskyřice ChemMatrix^® zabere v reakční nádobě podstatně více místa než běžné polystyrenové pryskyřice. Typické rozmezí zatížení se pohybuje mezi 0,4 a 0,7 mmol/g, což je srovnatelná vazebná kapacita jako u polystyrenových pryskyřic.

Obrázek 2. Bobtnavost pryskyřice ChemMatrix^® ve srovnání s polystyrenovou pryskyřicí.

Dvě nedávné nezávislé publikace přinášejí pozoruhodné důkazy o bezkonkurenční výkonnosti pryskyřice ChemMatrix^®. Při syntéze HIV-1 proteázy, velkého peptidu o 99 aminokyselinách, byla pryskyřice ChemMatrix^® porovnávána přímo s polystyrenem.² Jak jasně ukazují následující chromatogramy, požadovaný peptid je hlavní složkou surového produktu při použití ChemMatrix^® jako pevného nosiče (obrázek 3). Polystyrenové pryskyřice poskytují pouze surové směsi, které brání přímé lineární syntéze dlouhých peptidů.

Obrázek 3. HPLC chromatogramy proteázy HIV-1 (99 aminokyselin) po 78 aminokyselinách. Syntéza na pryskyřici ChemMatrix^® poskytuje požadovaný peptid přímo bez dalšího čištění (nahoře), zatímco polystyrenová pryskyřice poskytuje pouze velmi surovou směs (dole).

V druhém úžasném příkladu Bacsa et al. v roce 2010 oznámili syntézu polypeptidu Aβ(1-42) na pevném podkladu za asistence mikrovln.³ Aβ (1-42) hraje klíčovou roli v patogenezi Alzheimerovy choroby, neboť vytváří β-listové struktury a amyloidní fi grály, které vyvolávají neurotoxicitu. Jedná se tedy o klíčový materiál potřebný k dalšímu zkoumání molekulárních mechanismů Alzheimerovy choroby a potenciálních léčiv pro její léčbu. Vzhledem ke svému agregačnímu chování je tento peptid velmi obtížné syntetizovat. Pryskyřice ChemMatrix^® umožňuje přímou lineární syntézu pomocí standardní strategie syntézy Fmoc/t-Bu s použitím DIC/HOBt jako jednoduchého a levného spojovacího činidla. S výjimkou spojení tří histidinových zbytků citlivých na racemizaci, které bylo provedeno při pokojové teplotě, bylo syntézy dosaženo za kontrolovaných mikrovlnných podmínek při 86 °C. Pryskyřice ChemMatrix zůstala za těchto podmínek zcela stabilní.⁴ Nakonec byl Aβ(1-42) získán během 15h celkové doby zpracování ve vysokém výtěžku a čistotě (78% surový výtěžek).³

Kromě syntézy peptidů byla pryskyřice ChemMatrix^® úspěšně použita také v kombinatorické syntéze,⁵ pro syntézu derivátů oligonukleotidů,⁶ PNA,⁷ asymetricky substituovaných ftalocyaninů,⁸ a peptidových hybridů obsahujících nepřírodní chemické zbytky.⁹

Shrnem lze říci, že ChemMatrix^® překonává problémy spojené se syntézou delších a složitějších terapeutických peptidů. Peptidy vyrobené pomocí ChemMatrix^® mají vyšší čistotu a lze je získat s lepšími výtěžky. Peptidy, kterých bylo dosud možné dosáhnout pouze ligací nebo rekombinantními technikami, lze nyní syntetizovat přímo na pevném nosiči.

Pro syntézu peptidových kyselin doporučujeme používat ChemMatrix^® s kotvou HMPB, protože tato pryskyřice zajistí vysokou čistotu suroviny a výtěžnost 90-95 %. Wang-ChemMatrix^® poskytne podobnou surovou čistotu peptidů, ale výtěžnost výtěžnosti je nižší (60-70 %). Pryskyřice HMPB-ChemMatrix^® se rovněž dodávají s přednaplněnými nejběžnějšími aminokyselinami. V literatuře byla v poslední době publikována řada protokolů pro použití pryskyřice ChemMatrix.¹⁰

Vlastnosti pryskyřice ChemMatrix^®

• Výjimečná stabilita 
  Pryskyřice ChemMatrix^® je vyrobena výhradně z primárních éterových vazeb, které jsou vysoce chemicky stabilní. Během syntézy a štěpení nedochází k žádnému vyluhování.
• Vysoké zatížení 
  Pryskyřice ChemMatrix^® mají zatížení 0.4-0,7 mmol/g.
• Kompatibilita s rozpouštědly 
  ChemMatrix^® umožňuje použití téměř všech druhů rozpouštědel, dokonce i vody. Vysoká bobtnavost ChemMatrix^® ve vodě umožňuje vysoce výkonný postsyntetický následný screening.
• Všestranný výběr 
  Pryskyřice ChemMatrix^® je vybavena rozsáhlou škálou linkerů pro peptidové kyseliny, amidy a fragmenty. Pro syntézu peptidů jsou pro vaše pohodlí k dispozici také předpřipravené pryskyřice.
• Demonstrovaná superiorita 
  Pryskyřice ChemMatrix^® byla fi lmově ověřena pro snadnější a rychlejší vývoj dlouhých, komplexních a hydrofobních peptidů. Čím delší, složitější nebo hydrofobnější váš peptid je, tím větší zlepšení s ChemMatrix^® zaznamenáte.
• Mikrovlnná asistovaná syntéza 
  Na mikrovlnných syntetizátorech při 80 °C nedochází k žádnému vyluhování.

Odkazy

1. García-Martín F, Bayó-Puxan N, Cruz L, Bohling J, Albericio F. 2007. Chlorotrityl Chloride (CTC) Resin as a Reusable Carboxyl Protecting Group. QSAR Comb. Sci.. 26(10):1027-1035. https://doi.org/10.1002/qsar.200720015

2. Frutos S, Tulla-Puche J, Albericio F, Giralt E. 2007. Chemical Synthesis of 19F-labeled HIV-1 Protease using Fmoc-Chemistry and ChemMatrix Resin. Int J Pept Res Ther. 13(1-2):221-227. https://doi.org/10.1007/s10989-006-9070-z

3. Bacsa B, Bo?sze S, Kappe CO. 2010. Direct Solid-Phase Synthesis of the ?-Amyloid (1?42) Peptide Using Controlled Microwave Heating. J. Org. Chem.. 75(6):2103-2106. https://doi.org/10.1021/jo100136r

4. Subiros-Funosas R, Acosta GA, El-Faham A, Albericio F. 2009. Microwave irradiation and COMU: a potent combination for solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 50(45):6200-6202. https://doi.org/10.1016/j.tetlet.2009.08.117

5. Galanis AS, Albericio F, Grøtli M. 2009. Solid-Phase Peptide Synthesis in Water Using Microwave-Assisted Heating. Org. Lett.. 11(20):4488-4491. https://doi.org/10.1021/ol901893p

6. Marani MM, Marti?nez Ceron MC, Giudicessi SL, de Oliveira E, Co?te? S, Erra-Balsells R, Albericio F, Cascone O, Camperi SA. 2009. Screening of One-Bead-One-Peptide Combinatorial Library Using Red Fluorescent Dyes. Presence of Positive and False Positive Beads. J. Comb. Chem.. 11(1):146-150. https://doi.org/10.1021/cc800145c

7. Mazzini S, García-Martin F, Alvira M, Aviñó A, Manning B, Albericio F, Eritja R. 2008. Synthesis of Oligonucleotide Derivatives Using ChemMatrix Supports. C&B. 5(1):209-218. https://doi.org/10.1002/cbdv.200890012

8. Fabani MM, Abreu-Goodger C, Williams D, Lyons PA, Torres AG, Smith KGC, Enright AJ, Gait MJ, Vigorito E. 2010. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. 38(13):4466-4475. https://doi.org/10.1093/nar/gkq160

9. Erdem SS, Nesterova IV, Soper SA, Hammer RP. 2008. Solid-Phase Synthesis of Asymmetrically Substituted ?AB3-Type? Phthalocyanines. J. Org. Chem.. 73(13):5003-5007. https://doi.org/10.1021/jo800536v

10. Spengler J, Ruíz-Rodríguez J, Yraola F, Royo M, Winter M, Burger K, Albericio F. 2008. A Novel Protecting/Activating Strategy for ?-Hydroxy Acids and Its Use in Convergent Peptide Synthesis?. J. Org. Chem.. 73(6):2311-2314. https://doi.org/10.1021/jo7025788

11. García-Ramos Y, Paradís-Bas M, Tulla-Puche J, Albericio F. 2010. ChemMatrix® for complex peptides and combinatorial chemistry. J. Peptide Sci.. 16(12):675-678. https://doi.org/10.1002/psc.1282