Ni-NTA-Atto konjugáty pro citlivou a specifickou detekci polyhistidinem značených proteinů
Moderní aplikace rekombinantních proteinů vyžadují spolehlivé metody detekce. Polyhistidin je jednou z nejoblíbenějších afinitních značek zabudovaných do rekombinantních proteinů. Lze ji vložit buď na N-, nebo C-konec a exprimovat v různých hostitelích. Díky své malé velikosti slouží polyhistidinová značka jako elegantní nástroj pro purifikaci i detekci proteinů. Imunodetekce fúzních proteinů s His značkou na Western blotu obvykle používá protilátku proti polyhistidinu, následovanou sekundární protilátkou konjugovanou s enzymem, jako je křenová peroxidáza nebo alkalická fosfatáza. Protein se pak detekuje pomocí vhodného enzymového substrátu.
Konjugáty Ni-NTA-Atto umožňují specifickou a vysoce citlivou detekci fúzních proteinů s Hisovým značením. Komplex Ni-NTA-Atto (Nα,Nα-bis(karboxymethyl)-L-lysin, komplex niklu(II), konjugovaný s barvivem Atto) je specifický pro polyhistidinové značky s minimální křížovou reaktivitou. Atto barviva poskytují silné fluorescenční signály při běžně dostupných vlnových délkách a s malým zhášením. Konjugáty Ni-NTA-Atto lze přímo aplikovat buď na gel SDS-PAGE, nebo na membránu Western blotu pro fluorescenční zobrazení a byly úspěšně použity v živých buňkách.1,2 Detekce pomocí konjugátů Ni-NTA-Atto vyžaduje kratší inkubační dobu než při vazbě proteinu s protilátkou. Není nutná žádná sekundární reakce, protože komplex Ni-NTA je přímo konjugován s fluoroforem. Výsledkem je rychlejší a flexibilnější postup než u tradiční metody imunodetekce (obrázek 1).
Obrázek 1.Srovnání detekce proteinů tradiční chemiluminiscenční imunodetekcí protilátek (vlevo) s detekcí konjugátem Ni-NTA-Atto (vpravo). Imunodetekce probíhá na přenosové membráně po Western blotu, zatímco konjugáty Ni-NTA-Atto lze použít buď na přenosových membránách, nebo přímo na gelech SDS-PAGE po fixaci.
Přímá detekce proteinů značených histidinem na gelech SDS-PAGE
Přímá aplikace konjugátů Ni-NTA-Atto na gely SDS-PAGE umožňuje rychlou a snadnou detekci pro sledování purifikace proteinů nebo exprese proteinů v různých časových okamžicích. Pomocí fluorescenčního zobrazování byla zjištěna mez detekce 50 ng pro His značený p38 MAPK (obrázek 2).
Obrázek 2.Protein p38 MAPK s jeho značkou (500 ng - 25 ng) byl separován na 4-20% Tris-Glycin SDS-PAGE gelu. Gel byl přes noc fixován ve 40% ethanolu/10% kyselině octové, promyt vodou a inkubován s Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) ve tmě. Gel byl promyt a poté zobrazen pomocí laserového skeneru Fuji® FLA-3000 s excitačním filtrem 633 nm a emisním filtrem 675 nm. Ni-NTA-Atto 647N (λex 647 nm, λem 669 nm) je excitován v červené oblasti spektra.
Detekce proteinů značených histidinem po přenosu Western Blot
Po elektroforéze lze proteiny přenést z SDS-PAGE gelů na PVDF-membrány s nízkou fluorescencí, které jsou odolnější vůči manipulaci. Tradiční Western bloty fungují dobře pro polyhistidinové značky, ale jsou časově náročné. Konjugáty Ni-NTA-Atto spojují výhody vysoce specifické detekce s rychlejším postupem.
Aplikace konjugátů Ni-NTA-Atto na membránu poskytuje citlivost srovnatelnou s přímou detekcí na gelu. Vysušení membrány zvyšuje intenzitu signálu (obrázek 3). Kromě toho lze konjugáty Ni-NTA-Atto z použité membrány odstranit 60-90minutovou inkubací ve 20 mM EDTA.
Obrázek 3.Protein p38 MAPK značený His (500 ng - 25 ng) byl separován na 4-20% SDS-PAGE gelu. Protein byl přenesen na PVDF-membránu s nízkou fluorescencí, přes noc blokován 5% BSA v PBS, opláchnut PBS-T a inkubován s Ni-NTA-Atto 647N (1:1000) ve tmě. Membrána byla promyta a poté zobrazena pomocí laserového skeneru Fuji FLA-3000 s excitačním filtrem 633 nm a emisním filtrem 675 nm.
Srovnání postupů pro tradiční Western imunoblot a Ni-NTA-Atto konjugáty je uvedeno v Tabulce 1. Přímá detekce na gelu SDS-PAGE je nejpohodlnější, protože vynechává krok přenosu. U konjugátů Ni-NTA-Atto jsou pozorovány podobné limity detekce u membrán Western blotu ve srovnání s gely SDS-PAGE, ale bez rizika poškození gelu. V obou případech je doba práce kratší než u tradiční techniky s protilátkami.
Tabulka 1.Srovnání protokolů pro tradiční Western imunoblot, Western blot s použitím konjugátu Ni-NTA-Atto a přímou detekci na SDS-PAGE gelu s použitím konjugátu Ni-NTA-Atto. Zásobní roztok Ni-NTA-Atto se připraví rozpuštěním 250 μg v 250 μl PBS.
Konjugáty Ni-NTA-Atto představují cennou alternativu k tradiční imunodetekci protilátek pro specifickou a citlivou detekci fúzních proteinů značených His. Použití Ni-NTA-Atto zkracuje dobu experimentu a eliminuje časově náročné validační experimenty s protilátkami, čímž šetří čas i náklady.
Materiály
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?