Chymotrypsin

E.C. 3.4.21.1

• Produkty
• Fyzikální vlastnosti
• Specifičnost a kinetika 
• Inhibitory
• Substráty
• Rozpustnost a stabilita roztoku
/a>

Fyzikální vlastnosti

Molekulová hmotnost: 25 kDa¹  (hovězí)
pI: 8.752 (Bovine)
Extinction coefficient: E1%= 20,4 (280 nm)

Chymotrypsin se vytváří v acinárních buňkách slinivky břišní jako neaktivní prekurzor, chymotrypsinogen. α-chymotrypsin je převažující forma aktivního enzymu, který se vyrábí z jeho zymogenu, chymotrypsinogenu A.

In vivo vzniká v závislosti na rychlosti hydrolýzy zymogenu trypsinem a autolýzou různé množství variant α, π, δ a γ. Vlivem rychlosti hydrolýzy zymogenu trypsinem a autolýzou vzniká různé množství variant α, π, δ a γ.³ α-chymotrypsin je serinová proteáza z rodiny peptidáz S1, která se skládá z 241 aminokyselinových zbytků. Molekula má tři peptidové řetězce: řetězec A o 13 zbytcích, řetězec B o 131 zbytcích a řetězec C o 97 zbytcích.⁴

Obrázek 1. Fyzikální vlastnosti

Specificita a kinetika

α-Chymotrypsin z hovězí slinivky břišní selektivně katalyzuje hydrolýzu peptidových vazeb na C-koncové straně tyrosinu, fenylalaninu, tryptofanu a leucinu. K sekundární hydrolýze dojde také na C-koncové straně methioninu, isoleucinu, serinu, threoninu, valinu, histidinu, glycinu a alaninu.¹

pH optimum: (pH 6,0: asi 35 % maximální aktivity, pH 9,3: 40 % maximální aktivity)⁸

Teplotní optimum: 7,8⁸

Teplotní optimum: asi 35 % maximální aktivity: 50 °C⁹

α-Chymotrypsin je také zcela inhibován 10 mM Cu²⁺ a Hg²⁺.¹

Rozpustnost a stabilita roztoku

Chymotrypsin je obvykle rozpustný v 1 mM HCl (2 mg/ml) a poskytuje čirý roztok.

Rekonstituujte v 1 mM HCl obsahující 2 mM CaCl₂, alikvotujte a uchovávejte při -20 °C. Při skladování při vyšším pH dojde k autolýze. Přítomnost vápníku je rovněž stabilizátorem.⁵ Zmrazené alikvoty jsou stabilní přibližně 1 týden. Chymotrypsin je aktivován i stabilizován působením Ca²⁺. Enzym je aktivní v přítomnosti 0,1 % SDS a 2 M guanidin-hydrochloridu.

Použití

Pro trávení peptidů použijte poměr (w/w) přibližně 1:60 pro chymotrypsin:peptid. Digesci peptidů provádějte ve 100 mM Tris HCl obsahující 10 mM CaCl₂, pH 7,8, při 30 °C. Při teplotách nad 37 °C může dojít k samovolnému štěpení. Pro všechny experimenty by měl být jako kontrola použit známý peptid, například melittin. Inkubujte až 24 hodin při 37-40 °C. Digesci lze ukončit úpravou pH na 2,0.^6,7

Odkazy

1. Burrell MM. Enzymes of Molecular Biology. https://doi.org/10.1385/0896032345

2. Ui N. 1971. Isoelectric points and conformation of proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure. 229(3):582-589. https://doi.org/10.1016/0005-2795(71)90273-x

3. Desnuelle P, Boyer P. 1960. The Structure of Chymotrypsin. The Enzymes. 3185-191.

4. HESS G. 1971. The Enzymes. 3. New York: Academic Press.

5. Burrell MM. Enzymes of Molecular Biology. https://doi.org/10.1385/0896032345

6. Spackman D, Stein W, Moore S. 1960. The disulfide bonds of ribonuclease.. Journal of Biological Chemistry. 3(255):648-659.

7. Kamp RM. 1986. Separation of Peptides.8-20. https://doi.org/10.1007/978-3-642-71534-1_2

8. Ásgeirsson B, Bjarnason JB. 1991. Structural and kinetic properties of chymotrypsin from atlantic cod (Gadus morhua). Comparison with bovine chymotrypsin. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 99(2):327-335. https://doi.org/10.1016/0305-0491(91)90050-n

9. Fernández M, Villalonga MdL, Fragoso A, Cao R, Villalonga R. 2002. Stabilization of ?-chymotrypsin by modification with ?-cyclodextrin derivatives. Biotechnol. Appl. Biochem.. 36(3):235. https://doi.org/10.1042/ba20020056