Průvodce peptidovými spojovacími činidly

Přehled sekcí

• Související materiály
• In-situ aktivující-reagencie
• Fosfoniová versus uroniová činidla
• Souhrn uroniových a fosfonových spojovacích činidel
/a>
• Reference

Novabiochem^® značka nabízí jednu z nejširších řad vysoce kvalitních spojovacích činidel pro aktivaci in situ na trhu. Při takovém množství dostupných činidel však není výběr optimálního spojovacího činidla pro konkrétní aplikaci vždy jednoduchý. Kondenzační činidla se liší z hlediska účinnosti spojování, stability, rozpustnosti nebo reaktivity aktivních druhů.

In-situ aktivující činidla

In situ aktivační činidla jsou široce přijímána, protože se snadno používají, poskytují rychlé reakce, a to i mezi stericky překážejícími aminokyselinami, a jejich použití je obecně bez vedlejších reakcí. Většina z nich je založena na fosfoniových nebo aminiových (dříve známých jako uroniové) solích, které v přítomnosti terciární báze mohou hladce převádět chráněné aminokyseliny na různé aktivované formy (obrázek 1). Vlastnosti spojovacích činidel Novabiochem^® jsou shrnuty v tabulce 1.

Obrázek 1. Aktivní estery generované pomocí nejčastěji používaných spojovacích činidel.
P1A1 = TOTU, P1A2 = HBTU/TBTU, P1A3 = HCTU, P1A4 = HATU, P1A5 = TSTU
P2A1 = COMU
P3A1 = PyOxim, P3A2 = PyBOP, P3A3 = PyClock, P3A4 = PyAOP.

Nejčastěji používaná činidla BOP, PyBOP a HBTU vytvářejí estery OBt, které našly široké uplatnění v rutinní syntéze SPPS a roztokové syntéze pro obtížné vazby. K dispozici jsou také spojovací činidla, která generují estery reaktivnější než OBt. Nejdůležitější jsou HATU², PyAOP^1,3, a HCTU⁴, PyClocK, které v přítomnosti báze převádějí karboxylové kyseliny na odpovídající estery OAt, respektive O-6-ClBt. Tyto estery jsou reaktivnější než jejich OBt protějšky díky nižší pKa HOAt a HO-6-ClBt ve srovnání s HOBt. HOAt má navíc další výhodu v podobě pyridinového dusíku, který poskytuje anchiomerní pomoc při spojovací reakci, což činí z HATU a PyAOP nejúčinnější spojovací činidlo z řady OBt.

Nedávno byla zavedena spojovací činidla na bázi odstupující skupiny Oxyma Pure, z nichž nejužitečnější jsou COMU^5,6 a PyOxim⁷. Důkazy o relativní reaktivitě esterů Oxyma generovaných těmito činidly jsou nejednoznačné. Původní zprávy o těchto činidlech na bázi Oxyma naznačují, že jsou účinnější než činidla na bázi HOAt, zatímco naše interní testy⁸ ukazují, že lepší jsou činidla na bázi HOAt. Nicméně činidla na bázi Oxyma jsou vždy účinnější než činidla na bázi HOBt (PyBOP, HBTU) a O-6-ClBt (PyClocK a HCTU). Jednou z konkrétních výhod spojovacích činidel na bázi Oxyma je, že nejsou založena na potenciálně výbušných triazolových činidlech.

V našich experimentech se zdá, že účinnost spojovacího činidla téměř zcela souvisí s povahou aktivního esteru, který vytváří, přičemž pořadí reaktivity je OAt> Oxyma Pure > 2-ClOBt > OBt.  Zdá se, že struktura uroniové nebo fosfoniové složky má jen malý vliv.

Fosfoniová versus uroniová činidla

S výjimkou COMU jsou roztoky uroniových činidel v DMF výjimečně stabilní, takže jsou ideální pro použití na syntetizátorech, které využívají předem připravené roztoky spojovacích činidel. Naproti tomu roztoky fosfoniových činidel v DMF mají střední stabilitu a měly by se uchovávat v uzavřených lahvičkách a používat maximálně 2 dny. Fosfoniová činidla jsou však v DMF podstatně lépe rozpustná než uroniová činidla. To má důležité praktické důsledky, protože to umožňuje provádět reakce ve vyšších koncentracích se současným zvýšením účinnosti.

Fosfoniová spojovací činidla obecně poskytují čistší reakce než uronová činidla. Ta mohou způsobit ukončení řetězce guanidinylací Nkoncové aminoskupiny⁹. Tato vedlejší reakce je obzvláště problematická, pokud je aktivace karboxylu pomalá, například v případě fragmentačních a cyklizačních reakcí, nebo pokud se použije přebytek uroniového činidla. Tvorba těchto vedlejších produktů také způsobuje potíže při sestavování dlouhých peptidů, protože tyto krátké kladně nabité peptidy mohou maskovat přítomnost cílového iontu v hmotnostním spektru ESI.  Na rozdíl od uroniových činidel lze fosfoniová činidla použít v nadbytku a lze je dokonce použít k "napájení" pomalé cyklizační nebo fragmentové spojovací reakce, aby se pomohlo jejich dokončení.

Obrázek 2. Guanidinylace způsobená uroniovými spojovacími činidly.

Souhrn uroniových a fosfonových spojovacích činidel

Odkazy

1. Albericio F, Cases M, Alsina J, Triolo SA, Carpino LA, Kates SA. 1997. On the use of PyAOP, a phosphonium salt derived from HOAt, in solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 38(27):4853-4856. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(97)01011-3

2. Carpino LA. 1993. 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole. An efficient peptide coupling additive. J. Am. Chem. Soc.. 115(10):4397-4398. https://doi.org/10.1021/ja00063a082

3. Albericio F, Bofill JM, El-Faham A, Kates SA. 1998. Use of Onium Salt-Based Coupling Reagents in Peptide Synthesis1. J. Org. Chem.. 63(26):9678-9683. https://doi.org/10.1021/jo980807y

4. Marder O, Shvo Y, Albericio F. 2003. HCTU and TCTU: New Coupling Reagents ? Development and Industrial Aspects. ChemInform. 34(32): https://doi.org/10.1002/chin.200332258

5. El-Faham A, Funosas RS, Prohens R, Albericio F. 2009. COMU: A Safer and More Effective Replacement for Benzotriazole-Based Uronium Coupling Reagents. Chem. Eur. J.. 15(37):9404-9416. https://doi.org/10.1002/chem.200900615

6. Subirós-Funosas R, Nieto-Rodriguez L, Jensen KJ, Albericio F. 2013. COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents. J. Pept. Sci.. 19(7):408-414. https://doi.org/10.1002/psc.2517

7. Subirós-Funosas R, El-Faham A, Albericio F. 2010. PyOxP and PyOxB: the Oxyma-based novel family of phosphonium salts. Org. Biomol. Chem.. 8(16):3665. https://doi.org/10.1039/c003719b

8. Novabiochem Innovations 03/10.. [Internet]. Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/reagents-chemicals-and-labware/novabiochem-learning-center/novabiochem-publications/novabiochem-innovations/J2ib.qB.rDYAAAFLHaQp.xHd,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1

9. Gausepohl H, Pieles U, Frank R. 1992. Peptides: chemistry and biology. ESCOM. Leiden.523.