Stabilita peptidů a potenciální cesty degradace

Pro zabránění nebo minimalizaci degradace peptidu doporučujeme skladovat peptid v lyofilizované formě při -20 °C nebo -80 °C. Jakmile je peptid/protein v roztoku, měl by být uchováván zmrazený v jednotlivých alikvotech, aby se zabránilo cyklům zmrazování a rozmrazování. Rovněž je třeba se vyhnout dlouhodobému vystavení pH>8 a roztoky by měly být chlazeny. A konečně by se mělo minimalizovat dlouhodobé vystavení lyofilizovaných peptidů a roztoků (zejména při vysokém pH) působení atmosférického kyslíku.

Primárním faktorem určujícím stabilitu peptidu/proteinu je aminokyselinové složení a sekvence. Obecně platí, že peptidy/proteiny dodávané v lyofilizované podobě jsou stabilnější než jejich protějšky v roztoku. Následující jsou potenciální cesty degradace peptidů:

1. Hydrolyza - To je obecně problém u peptidů obsahujících v sekvenci Asp (D), který je velmi náchylný k dehydrataci za vzniku cyklického imidového meziproduktu. Například v přítomnosti Asp-Pro (D-P) v sekvenci může kyselinou katalyzovaná tvorba cyklického imidového meziproduktu vést ke štěpení peptidového řetězce. Podobně v přítomnosti Asp-Gly (D-G) v sekvenci může být cyklický meziprodukt hydrolyzován buď na původní Asp formu (neškodnou), nebo na potenciálně neaktivní iso-aspartátový analog. Nakonec může být veškerá aspartátová forma zcela přeměněna na iso-aspartátový analog. V menší míře mohou sekvence obsahující Ser (S) také tvořit cyklický imidový meziprodukt, který může skončit štěpením peptidového řetězce.
   
   
2. Deamidace - K této reakci katalyzované bází často dochází u sekvencí obsahujících Asn-Gly (N-G) nebo Gln-Gly (Q-G) a probíhá mechanismem analogickým sekvenci Asp-Gly (D-G). Deamidace (ztráta aminu) sekvence Asn-Gly vytváří cyklický imidový meziprodukt, který je následně hydrolyzován za vzniku aspartátového nebo iso-aspartátového analogu Asn. Kromě toho může cyklický imidový meziprodukt vést k racemizaci na D-Asp nebo D-iso-Asp analogy Asn, z nichž všechny mohou být potenciálně neaktivní formy.
   
   
3. Oxidace - Zbytky Cys a Met jsou převažující zbytky, které podléhají reverzibilní oxidaci. Oxidace cysteinu se urychluje při vyšším pH, kdy je thiol snadněji deprotonován a snadno vytváří vnitrořetězcové nebo meziřetězcové disulfidické vazby. Disulfidové vazby lze snadno zrušit působením dithiotreitolu (DTT) nebo tris(2-karboxyethylfosfin) hydrochloridu (TCEP). Methionin se oxiduje jak chemickou, tak fotochemickou cestou za vzniku methioninsulfoxidu a dále na methioninsulfon, přičemž oba tyto procesy je téměř nemožné zvrátit.
   
   
4. Tvorba diketopiperazinu a kyseliny pyroglutamové - K tvorbě diketopiperazinu obvykle dochází, pokud se Gly nachází ve třetí poloze od N-konce, a to zejména pokud se Pro nebo Gly nachází v poloze 1 nebo 2. Diketopiperazin se obvykle tvoří v případě, že se Gly nachází v poloze 1 nebo 2. Diketopiperazin se tvoří v případě, že se Gly nachází v poloze 2. Reakce zahrnuje nukleofilní útok dusíku N-konce na amidový karbonyl mezi druhou a třetí aminokyselinou, což vede k odštěpení prvních dvou aminokyselin ve formě diketopiperazinu. Na druhé straně je tvorba kyseliny pyroglutamové téměř nevyhnutelná, pokud je Gln na N-konci. Jedná se o analogickou reakci, při níž dusík na N-konci atakuje karbonylový uhlík postranního řetězce Gln za vzniku deaminovaného analogu pyroglutamaylu v peptidu. K této přeměně dochází také u peptidů obsahujících Asn na N-konci, ale v mnohem menší míře.
   
   
5. Racemizace - Tento termín se volně používá pro označení celkové ztráty chirální integrity aminokyseliny nebo peptidu. Racemizace zahrnuje bází katalyzovanou přeměnu jednoho enantiomeru (obvykle L-formy) aminokyseliny na směs L- a D-enantiomerů v poměru 1:1. Racemizace je také proces, při kterém dochází ke změně chirálního složení aminokyseliny. To představuje větší problém při syntéze peptidů, ale mnohem menší problém u hotového peptidu. Navíc je tato přeměna velmi těžko zjistitelná a obtížně kontrolovatelná.