Protokol extrakce DNA z bukální sliznice a amplifikace WGA

Tento protokol poskytuje jednoduchou a pohodlnou metodu izolace, amplifikace a purifikace genomové DNA z bukálních stěrů. Stěry z bukální sliznice jsou vhodnou metodou pro získání vzorku DNA. Jakmile je DNA izolována pomocí protokolu extrakce miniprep, lze ji amplifikovat pomocí protokolu amplifikace celého genomu.

Protokol minipreplikace genomové DNA

Pro dosažení nejlepších výsledků použijte k tomuto postupu soupravu GenElute pro minipreplikaci genomové DNA savců (G1N10).

1. Odebrané tampony sušte 15 minut při pokojové teplotě.
2. Přidejte 280 μl lyzačního roztoku T a 20 μl proteinázy K. Vložte tampon a jemně roztočte. Zkumavku uzavřete a promíchejte vířením.
3. Inkubujte vzorek při 55 °C po dobu 20 minut za občasného víření.
4. Přidejte 200 μl lyzačního roztoku C a důkladně vířte po dobu 15 sekund.
5. Inkubujte 10 minut při 70 °C.
6. Přidejte 500 μl roztoku pro přípravu kolonek ke každé vazebné kolonce GenElute Miniprep (červený o-kroužek) a odstřeďujte 1 minutu při 12 000 × g. Zlikvidujte průtokovou kapalinu.
   Poznámka: Roztok pro přípravu kolonky maximalizuje vazbu DNA na membránu, což vede ke konzistentnějším výtěžkům
7. Přidejte 200 μl 95-100% ethanolu k lyzátu z kroku 5.
8. Důkladně promíchejte vířením a přidejte celý obsah zkumavky do vazebné kolonky.
9. Centrifugujte při ≥6500 × g po dobu 1 minuty.
10. Vyhoďte sběrnou zkumavku obsahující průtok a vložte vazebnou kolonu do nové 2ml sběrné zkumavky.
11. Přidejte 500 μl promývacího roztoku (před prvním použitím nezapomeňte zředit ethanolem) a centrifugujte při ≥6500 × g po dobu 1 minuty.
12. Vyhoďte sběrnou zkumavku a průtok a vložte vazebnou kolonu do nové 2ml sběrné zkumavky.
13. Přidejte dalších 500 μl promývacího roztoku k vazebné koloně a odstřeďujte při maximální rychlosti (12 000-16 000 × g) po dobu 3 minut, aby se vazebná kolona vysušila.
14. Na vazebnou kolonu napipetujte 200 μl elučního roztoku a odstřeďujte 1 minutu při rychlosti ≥6500 × g.
15. Eluovanou DNA uložte při -20 °C nebo přejděte ke kroku amplifikace.
    Poznámka: Pokud používáte WGA2 není třeba dodávat DNA polymerázu, protože enzym je dodáván se soupravou
    

Protokol amplifikace celého genomu (WGA)

Protokol pro amplifikaci celého genomu GenomePlex prováděnou pomocí soupravy pro amplifikaci celého genomu GenomePlex (WGA1) a/nebo soupravy pro kompletní amplifikaci celého genomu (WGA2).

Fragmentace

1. Připravte roztok DNA o koncentraci 1 ng/ml z výše popsaného protokolu extrakce z plné krve.
2. Přidejte 1 µl 10X fragmentačního pufru k 10 µl DNA (1 ng/µl) ve zkumavce PCR.
3. Vložte zkumavku do termálního cykleru při teplotě 95 °C přesně na 4 minuty. Upozorňujeme, že inkubace je časově citlivá a jakákoli odchylka může změnit výsledky. 
4. Prodleně vzorek zchlaďte na ledu a krátce odstřeďte.

Příprava knihovny

1. Přidejte 2 µl 1x pufru pro přípravu knihovny. 
2. Přidejte 1 µl roztoku pro stabilizaci knihovny.
3. Důkladně promíchejte a vložte na 2 minuty do termálního cykléru při 95 °C.
4. Zchlaďte vzorek na ledu a krátce odstřeďte.
5. Přidejte 1 µl enzymu pro přípravu knihovny, důkladně promíchejte a krátce odstřeďte.
6. Vložte vzorek do termocykléru a inkubujte následujícím způsobem:
       16 °C po dobu 20 minut
       24 °C po dobu 20 minut
       37 °C po dobu 20 minut.br>     75 °C po dobu 5 minut
       4 °C hold
7. Vyjměte vzorky z termocykleru a krátce odstřeďte. Vzorky lze amplifikovat okamžitě nebo je lze skladovat při teplotě -20 °C až tři dny.
   

Amplifikace

1. Přidejte následující činidla do celé 15 µl reakce:
       7. Vložte do reakce 15 µl.5 µl 10x Amplification Master Mix
       47,5 µl Nuclease Free Water
       5,0 µl JumpStart Taq DNA Polymerase (12.5 jednotek) pro WGA1
       -nebo-
       5.0 µl WGA DNA polymerázy pro WGA2
2. Důkladně promíchejte, krátce odstřeďte a zahajte termocyklaci.br>
3. Po dokončení cyklování udržujte reakce při 4 °C nebo je uchovávejte při -20 °C, dokud nebudou připraveny k analýze nebo purifikaci.
   

Reamplifikace

1. Přidejte 10 µl amplifikované DNA WGA o koncentraci 1 ng/ml do zkumavky PCR nebo na vícejamkovou destičku.
   Poznámka: Je nutné reakci WGA vyčistit, aby se snížilo možné zkreslení při reamplifikaci. Doporučujeme použít naši sadu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (číslo výrobku NA1020) nebo standardní purifikační metody, které izolují jedno- a dvouvláknovou DNA.
2. Vytvořte amplifikační směs. Pro každou reamplifikační reakci přidejte k amplifikované DNA WGA (krok 1) následující:
       47,5 µl vody bez nukleázy
       7.5 µl 10X Amplification Master Mix
       5 µl WGA DNA Polymerase
3. Důkladně promíchejte, krátce odstřeďte a zahajte termocyklaci. Následující profil byl optimalizován pro termocykler PE 9700 nebo ekvivalentní termocykler:
       Počáteční denaturace 95 °C po dobu 3 minut
       Proveďte 14 cyklů následujícím způsobem:<        Denaturace 94 °C po dobu 15 sekund
           Žíhání/rozpouštění 65 °C po dobu 5 minut
4. Po dokončení cyklování udržujte reakce při 4 °C nebo je uchovávejte při -20 °C, dokud nebudou připraveny k analýze nebo purifikaci. Stabilita DNA WGA je rovnocenná genomové DNA skladované za stejných podmínek.
   

Purifikace amplifikovaných vzorků bukálního stěru

Purifikace amplifikovaných produktů provedená pomocí sady GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)

1. Vložte vazební kolonku GenElute Miniprep (s modrým O-kroužkem) do dodané sběrné zkumavky, pokud již není sestavena. Přidejte 0,5 ml roztoku pro přípravu kolonek do každé miniprepové kolonky a odstřeďujte při 12 000 x g po dobu 30 sekund až 1 minuty. Eluát zlikvidujte.
   Poznámka: Roztok pro přípravu kolonek maximalizuje vazbu DNA na membránu, což vede ke konzistentnějším výtěžkům.
2. Přidejte 5 objemů vazebného roztoku k 1 objemu reakce PCR a promíchejte. Například přidejte 500 µl Vazného roztoku ke 100 µl reakce PCR. Roztok přeneste do vazebné kolony. Kolonu odstřeďujte při maximální rychlosti (12 000 až 16 000 x g) po dobu 1 minuty. Eluát zlikvidujte, ale sběrnou zkumavku si ponechte.
3. Vázací kolonu opět vložte do sběrné zkumavky. Naneste na kolonu 0,5 ml zředěného promývacího roztoku a odstřeďujte při maximálních otáčkách po dobu 1 minuty. Eluát zlikvidujte, ale sběrnou zkumavku si ponechte.
   Poznámka: Před prvním použitím nezapomeňte do koncentrátu promývacího roztoku přidat ethanol. Viz Pokyny pro přípravu.
4. Znovu vložte kolonu do sběrné zkumavky. Odstřeďujte kolonu při maximálních otáčkách po dobu 2 minut bez dalšího promývacího roztoku, abyste odstranili přebytečný etanol. Zbytkový eluát i sběrnou zkumavku zlikvidujte.
5. Přeneste kolonu do čerstvé 2ml sběrné zkumavky. Do středu každé kolony naneste 50 µl elučního roztoku nebo vody. Inkubujte při pokojové teplotě po dobu 1 minuty.
   Poznámka: Při eluci vodou se ujistěte, že pH vody je v rozmezí 5,5 až 8,5. Eluci lze také provést pomocí Elution Solution (Elučního roztoku) zředěného 10krát vodou.
6. Pro eluci DNA odstřeďujte kolonu při maximální rychlosti po dobu 1 minuty. Produkt amplifikace PCR je nyní přítomen v eluátu a je připraven k okamžitému použití nebo ke skladování při -20 °C.
   

Kvantifikace amplifikovaných vzorků bukálního stěru

Množství DNA amplifikované pomocí amplifikace celého genomu lze zjistit s čištěním nebo bez něj. Pro získání vzorků DNA nejvyšší kvality se důrazně doporučuje vzorky po amplifikaci přečistit. Amplifikované produkty lze měřit pomocí testu PicoGreen^® dsDNA Quantitation Assay od společnosti Molecular Probes Inc (7589). Další metodou detekce amplifikovaných produktů je spektrofotometrická absorpce (OD260) na spektrofotometru NanoDrop^® . Tento přístroj dokáže měřit absorbanci na 1 μl vzorku ve velkém dynamickém rozsahu (2-3 700 ng/μl).

Aplikační údaje pro amplifikaci vzorku bukálního stěru

Amplifikace celého genomu provedená na vzorku bukálního stěru

Amplifikované produkty se vizualizují na 1,5% agarózovém gelu. Do každé jamky bylo vloženo 5 µl amplifikovaného produktu. Výsledkem amplifikovaných produktů GenomePlex je průměrná velikost 400 bp. Vzor rozmazání se liší podle zdroje, jak je znázorněno na gelu.

Pruh 1 - 1 kb žebříček
Pruh 2 - krev
Pruh 3 - rostlina
Pruh 4 - bukální stěr
Pruh 5 - půda
Pruh 6 - pozitivní kontrola
Pruh 7 - 1 kb žebříček

Další potřebné materiály

• Bukální tampon
• 1.5 ml mikrocentrifugační zkumavky
• Mikrocentrifuga (s rotorem pro 2 ml zkumavky)
• 55 °C vodní lázeň nebo tepelný blok