Domů Purifikace DNA a RNAGenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Protokol

GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Protocol ;

Popis produktu

Sada GenElute™ pro miniprepaci genomové DNA savců poskytuje jednoduchý a pohodlný způsob izolace čisté genomové DNA z různých kultivovaných buněk, tkání (včetně ocasů hlodavců) a čerstvé plné krve nebo bílých krvinek. Souprava kombinuje výhody vazby oxidu křemičitého s formátem mikrospin a eliminuje potřebu drahých pryskyřic, srážení alkoholem a nebezpečných organických sloučenin, jako je fenol a chloroform. Výchozí materiály jsou lyzovány v chaotropním roztoku obsahujícím soli, aby byla zajištěna důkladná denaturace makromolekul. Přidání ethanolu způsobí, že se DNA naváže při odstřeďování lyzátu přes křemíkovou membránu v mikrocentrifugační zkumavce. Po promytí za účelem odstranění kontaminantů se DNA eluuje ve 200 µl roztoku Tris-EDTA.

Očekávané výtěžky genomové DNA se liší v závislosti na množství a typu použitého výchozího materiálu (například 15-25 µg DNA ošetřené RNázou A lze izolovat z 2 x 10⁶ HeLa buněk za méně než jednu hodinu). DNA purifikovaná pomocí soupravy má poměr A₂₆₀/A₂₈₀ mezi 1,6 a 1,9 a může mít délku až 50 kb. Tato DNA je připravena pro následné aplikace, jako je štěpení restrikčními endonukleázami, PCR, Southernovy bloty a sekvenační reakce

Potřebná činidla a vybavení, které nejsou součástí dodávky

- vodní lázeň o teplotě 55 °C nebo třepací vodní lázeň
- vodní lázeň o teplotě 70 °C nebo topný blok
- Hroty pro pipety s aerosolovou bariérou (doporučeno)
- 1. V případě, že se jedná o kapalinu, je třeba ji vyčistit.5 ml mikrocentrifugační zkumavka pro lýzu
- Mikrocentrifuga (2 ml zkumavka, vybavená rotorem)*
- Etanol (95-100 %), kat. č. E7148, E7023, nebo 459836
- Voda na molekulárně biologická činidla, katalogové číslo W4502
*Poznámka: Pro zajištění správného uložení všech zkumavek se doporučuje 24místný rotor. Pokud používáte
36místný rotor, doporučujeme pro správné uložení zkumavek použít každé druhé místo

Skladování a stabilita

Soupravu skladujte při pokojové teplotě. Pokud některé činidlo soupravy vytvoří sraženinu, zahřívejte při teplotě 55-65 °C, dokud se sraženina nerozpustí, a před použitím ji nechte vychladnout na pokojovou teplotu.

Pokyny k přípravě

Před zahájením postupu proveďte následující:

1. Vezměte si na starost, co je třeba udělat. Předehřejte vodní lázeň nebo třepací vodní lázeň na teplotu 55 °C
Pro použití s tkáněmi, ocásky hlodavců, čerstvou plnou krví a bílými krvinkami.

2. Předehřejte vodní lázeň nebo ohřívací blok na 70 °C
Pro použití s kultivovanými buňkami a tkáněmi.

3. Předehřejte vodní lázeň nebo ohřívací blok na 70 °C. Důkladně promíchejte činidla
Zkontrolujte, zda se činidla nesrážejí. Pokud některé činidlo vytvoří sraženinu, zahřívejte při teplotě 55-65 °C, dokud se sraženina nerozpustí, a před použitím ji nechte vychladnout na pokojovou teplotu.

4. Zkontrolujte, zda se činidlo nerozpustilo. Zřeďte koncentrát promývacího roztoku
Koncentrát zřeďte 10 ml (10 přípravných balení), 80 ml (70 přípravných balení) nebo 360 ml (350 přípravných balení) 95-100% ethanolu. Po každém použití naředěný promývací roztok pevně uzavřete, aby se zabránilo odpařování etanolu.

5. V případě potřeby nařeďte roztok naředěním. Rozpusťte Proteinázu K ve vodě
Podle níže uvedené tabulky 1 rozpusťte prášek v jedné lahvičce Proteinázy K ve vodě (katalogové číslo W4502), abyste získali zásobní roztok 20 mg/ml. Tento roztok lze skladovat několik dní při teplotě 2-8 °C. Pro dlouhodobější skladování lze nepoužitou část roztoku uchovávat v alikvotech při -20 °C, dokud nebude potřeba. Tento produkt, jak je dodáván, je stabilní při pokojové teplotě.
Roztok Proteinázy K musí být pokaždé přidán přímo ke každému přípravku vzorku. Nekombinujte roztoky Proteinázy K a lyzační roztok pro skladování.

Postup

Poznámka: Pokud je v následných aplikacích požadována minimálně sestříhaná genomová DNA, např, při použití konečného produktu pro dlouhou amplifikaci PCR, v následujícím postupu namísto víření promíchejte jemným pipetováním nebo inverzí do homogenní podoby.

A. Příprava kultivovaných buněk

1a. Sklízení buněk
- Připojené buněčné kultury: Uvolněte buňky trypsinem. Peletujte až 5 × 10⁶ buněk po dobu 5 minut při 300 × g; kultivační médium zcela odstraňte a zlikvidujte. Pokračujte krokem 2a.
- Suspenzní buněčné kultury: Peletovat až 5 × 10⁶ buněk po dobu 5 minut při 300 × g; zcela odstranit kultivační médium a zlikvidovat. Pokračujte krokem 2a.

Poznámka: Buňky lze odebrat, alikvotovat do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a bleskově zmrazit v tekutém dusíku, poté je před přípravou DNA skladovat při teplotě
-70 °C po dobu několika měsíců.

2a. Resuspendujte buňky
Pelety důkladně resuspendujte ve 200 µl resuspenzního roztoku. Pokud byla předtím zmrazena, nechte buněčnou peletu před resuspendací mírně rozmrazit. Pokud zbytková RNA nepředstavuje problém, pokračujte krokem 3a.

Volitelné ošetření RNázou A: Pokud je požadováno odstranění genomové DNA bez RNA, přidejte 20 µl roztoku RNázy A a inkubujte 2 minuty při pokojové teplotě, poté pokračujte krokem 3a.

3a. Lyzace buněk
Přidejte ke vzorku 20 µl roztoku Proteinázy K a poté 200 µl lyzačního roztoku C (B8803). Důkladně promíchejte (asi 15 sekund) a inkubujte při 70 °C po dobu 10 minut. Pro účinnou lýzu je nezbytná homogenní směs. Pokračujte krokem 4.

Obrázek 1. Genomická DNA přečištěná z buněk pomocí sady GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit. Purifikovaná genomová DNA byla izolována pomocí soupravy GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit z 2 x 10⁶ buněk uvedených zdrojů. Genomová DNA (200 ng/l) byla analyzována na 0,8% agarózovém gelu. Markery jsou lambda DNA štěpené pomocí Hind III.

B. Příprava savčích tkání

1b. Příprava tkáně
Rychle rozmělněte a zvažte kus čerstvé nebo zmrazené tkáně. Zmrazenou tkáň nechte před krájením mírně rozmrazit, ale uchovávejte ji na ledu, abyste ji chránili před degradací. Nakrájení tkáně na malé kousky umožňuje účinnější lýzu. Na jeden přípravek lze použít až 25 mg tkáně (nebo 10 mg sleziny vzhledem k vysokému počtu buněk na danou hmotnost). Přeneste do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a pokračujte krokem 2b.

Poznámka: Tkáň lze odebrat, alikvotovat do 1,5 ml mikrocentrifugačních zkumavek a bleskově zmrazit v kapalném dusíku, poté skladovat při
-70 °C po dobu několika měsíců před přípravou DNA.

2b. Digestujte tkáň
Přidejte do tkáně 180 µl lyzačního roztoku T (B6678) a následně 20 µl roztoku Proteinázy K. Přidejte do tkáně 20 µl roztoku Proteinázy K. Promíchejte vířením. Vzorek inkubujte při 55 °C, dokud není tkáň zcela rozštěpena a nezůstanou v ní žádné částice. Občas vířete nebo použijte třepací vodní lázeň. Trávení je obvykle dokončeno za 2 až 4 hodiny. Po dokončení rozkladu krátce vortexujte.

Volitelné ošetření RNázou A: Pokud zbytková RNA nepředstavuje problém, pokračujte krokem 3b. Pokud je požadována genomická DNA bez RNA, přidejte 20 µl roztoku RNázy A a inkubujte 2 minuty při pokojové teplotě, poté pokračujte krokem 3b.

3b. Lyzace buněk
Ke vzorku přidejte 200 µl lyzačního roztoku C (B8803); důkladně promíchejte (15 sekund). Pro účinnou lyzi je nezbytná homogenní směs. Inkubujte při 70 °C po dobu 10 minut. Pokračujte krokem 4.

Obrázek 2. Genomová DNA purifikovaná z tkání pomocí sady GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit. Purifikovaná genomová DNA z uvedených myších tkání byla izolována pomocí soupravy GenElute™ Mammalian Genomic DNA Purification Kit. Genomová DNA (200 ng/l) byla analyzována na 0,8% agarózovém gelu, aby se ilustrovala výtěžnost a integrita. Markery jsou lambda DNA štěpené pomocí Hind III.

C. Příprava ocasu hlodavců

1c. Připravte ocasy hlodavců
Rychle odměřte a odřízněte kus čerstvého nebo zmrazeného ocasu hlodavce. Zmrazený ocas hlodavce nechte před řezáním mírně rozmrazit, ale uchovávejte jej na ledu, abyste jej chránili před degradací. Na jeden přípravek nepoužívejte více než 0,6 cm (potkan) nebo 1,2 cm (myš) ocasu. Odřízněte dva (myš) nebo jeden (potkan) 0,5-0,6 cm dlouhý ocas a vložte je do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky; pokračujte krokem 2c.

Poznámka: Ocas hlodavce lze před přípravou DNA skladovat při -20 °C po dobu několika měsíců.

2c. Digestujte tkáň
Do ocasu hlodavce přidejte 180 µl lyzačního roztoku T (B6678) a následně 20 µl roztoku Proteinázy K. V případě, že je tkáň rozpuštěna, přidejte do ocasu hlodavce ještě 20 µl roztoku Proteinázy K. Promíchejte vířením; ujistěte se, že je ocas zcela ponořen. Vzorek inkubujte při 55 °C, dokud není ocasní tkáň zcela natrávena. Některé částice (kosti a chlupy) mohou zůstat. Během inkubace občas vířivě promíchejte nebo použijte třepací vodní lázeň, aby se trávení urychlilo. Trávení je obvykle dokončeno za 3 až 6 hodin. Po dokončení rozkladu krátce promíchejte. Pokud zbytková RNA nepředstavuje problém, pokračujte krokem 3.

Volitelné ošetření RNázou A: Pokud je požadována genomická DNA bez RNA, přidejte 20 µl roztoku RNázy A a inkubujte 2 minuty při pokojové teplotě; pokračujte krokem 3c.

3c. Lyzace buněk
Přidejte ke vzorku 200 µl lyzačního roztoku C (B8803); důkladně promíchejte (15 sekund). Pro účinnou lyzi je nezbytná homogenní směs. Pokračujte krokem 4.

D. Příprava plné krve

1d. Odeberte krev
Odeberte plnou krev do zkumavky s protisrážlivými látkami (upřednostňuje se zkumavka s EDTA). Plná krev by měla být před zahájením přípravy vyrovnána na pokojovou teplotu.

2d. Příprava krve
Do mikrocentrifugační zkumavky o objemu 1,5 µl umístěte 20 µl roztoku Proteinázy K. Vložte do ní 20 µl roztoku Proteinázy K. Do zkumavky přidejte až 200 µl vzorku plné krve. Pokud je vzorek menší než 200 µl, přidejte resuspenzní roztok, aby se objem zvýšil na 200 µl.

Poznámka: Pokud je vzorek již dávkován ve zkumavce, lze roztok Proteinázy K přidat ke vzorku. Vortexujte, abyste zajistili důkladné promíchání enzymu. Celou krev lze před přípravou DNA uchovávat několik hodin při teplotě 4 °C. Pokud není zbytková RNA problémem, pokračujte krokem 3d.

Volitelné ošetření RNázou A: Pokud je požadována genomová DNA bez RNA, přidejte 20 µl roztoku RNázy A a inkubujte 2 minuty při pokojové teplotě; pokračujte krokem 3d.

3d. Lyzace buněk
Přidejte ke vzorku 200 µl lyzačního roztoku C (B8803); důkladně promíchejte (15 sekund). Pro účinnou lyzi je nezbytná homogenní směs. Inkubujte při 55 °C po dobu 10 minut. Pokračujte krokem 4.

E. Příprava bílých krvinek (WBC)

1e. Příprava bílých krvinek z plné krve
Připravte bílé krvinky z 500 µl plné krve na jeden přípravek; Dodatek pro postup lýzy chloridem amonným.

2e. Resuspendujte buňky
Pelety důkladně resuspendujte ve 200 µl resuspenzního roztoku; přidejte ke vzorku 20 µl roztoku Proteinázy K a krátce vortexujte, abyste zajistili důkladné promíchání enzymu. Pokud zbytková RNA nepředstavuje problém, pokračujte krokem 3e.

Volitelné ošetření RNázou A:

3e: Pokud je požadována genomová DNA bez RNA, přidejte 20 µl roztoku RNázy A a inkubujte 2 minuty při pokojové teplotě, poté pokračujte krokem 3e.

3e. Lyzace buněk
Přidejte ke vzorku 200 µl lyzačního roztoku C (B8803); důkladně promíchejte. Pro účinnou lyzi je nezbytná homogenní směs. Inkubujte při 55 °C po dobu 10 minut. Pokračujte krokem 4.

Izolace DNA ze všech uvedených typů vzorků

Toto je pokračování postupu ze vzorků připravených v oddílech A, B, C, D a E.

4. V případě, že se jedná o vzorky připravené v oddílech A, B, C, D a E, je třeba provést izolaci DNA ze všech uvedených typů vzorků. Příprava kolonky
Přidejte 500 µl roztoku pro přípravu kolonky do každé předem sestavené vazebné kolonky GenElute™ Miniprep (s červeným o-kroužkem, nezaměňovat s jinými sadami GenElute™) a odstřeďte při 12 000 × g po dobu 1 minuty. Zlikvidujte průtokovou kapalinu.

Poznámka: Roztok pro přípravu kolonky maximalizuje navázání DNA na membránu, což vede ke konzistentnějším výtěžkům.

5. Zkontrolujte, zda je DNA na membránu navázána správně. Příprava na vazbu
K lyzátu přidejte 200 µl ethanolu (95-100 %); důkladně promíchejte vířením po dobu 5-10 sekund. Důležitý je homogenní roztok.

6. Vezměte si na starost, zda je roztok homogenní. Naložte lyzát
Přeneste celý obsah zkumavky do ošetřené vazebné kolony z kroku 4. Použijte pipetovací špičku se širokým otvorem, abyste omezili střihání DNA při přenášení obsahu do vazebné kolony. Odstřeďujte při ≥6500 × g po dobu 1 minuty. Vyhoďte sběrnou zkumavku obsahující průtokovou kapalinu a vložte vazebnou kolonu do nové 2 ml sběrné zkumavky.

7. Odstředěním zkontrolujte, zda je kolona v pořádku. První promývání
Před prvním použitím zřeďte koncentrát promývacího roztoku ethanolem podle popisu v části Pokyny pro přípravu. Přidejte 500 µl promývacího roztoku do vazebné kolony a odstřeďujte 1 minutu při ≥6 500 × g. Zlikvidujte sběrnou zkumavku obsahující průtokovou kapalinu a umístěte vazebnou kolonu do nové 2 ml sběrné zkumavky.

8. Odstředěte zkumavku s průtokovou kapalinou. Druhé promývání
Přidejte k vazebné koloně dalších 500 µl promývacího roztoku; odstřeďujte 3 minuty při maximální rychlosti (12 000-16 000 × g), aby se vazebná kolona vysušila. Před elucí DNA musí být vazebná kolona zbavena ethanolu. Pokud se objeví zbytky ethanolu, odstřeďujte kolonu další minutu při maximální rychlosti. Pokud potřebujete tento dodatečný krok odstředění, můžete sběrnou zkumavku vyprázdnit a znovu použít. Nakonec zlikvidujte sběrnou zkumavku obsahující průtokovou kapalinu a umístěte vazebnou kolonu do nové 2ml sběrné zkumavky.

9. Zkumavku s průtokovou kapalinou vyjměte. Eluce DNA
Napipetujte 200 µl elučního roztoku přímo do středu vazebné kolony; pro eluci DNA odstřeďujte 1 minutu při ≥6 500 × g . Pro zvýšení účinnosti eluce inkubujte 5 minut při pokojové teplotě po přidání Elution Solution a poté odstřeďte.

Volitelně: Druhou eluci lze získat opakováním kroku 9 s dalšími 200 µl Elution Solution a elucí do nové 2ml sběrné zkumavky (dodané) nebo do stejné 2ml sběrné zkumavky, která byla použita pro první eluát.

Eluát obsahuje čistou genomovou DNA. Pro krátkodobé skladování DNA se doporučuje teplota 2-8 °C. Pro dlouhodobé skladování DNA se doporučuje teplota -20 °C. Vyvarujte se zmrazování a rozmrazování, které způsobuje zlomy ve vlákně DNA. Elution Solution pomůže stabilizovat DNA při těchto teplotách.

Srážení DNA (volitelné)

Sada GenElute™ pro genomovou DNA savců je navržena tak, aby DNA vždy zůstala v roztoku, čímž se předejde problémům s resuspenzí. Pokud však považujete za nutné DNA koncentrovat, doporučuje se srážení etanolem za přítomnosti octanu sodného.

Výsledky

Koncentraci a kvalitu genomové DNA připravené pomocí soupravy GenElute™ lze určit pomocí spektrofotometrické analýzy a elektroforézy v agarózovém gelu. DNA nařeďte v TE pufru (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0-8,5) a změřte absorbanci při 260 nm a 280 nm pomocí křemenné mikrokvety. Absorbance by měla být mezi 0,1 a 1,0 (nebo v lineárním rozsahu vašeho spektrofotometru). Absorbance 1,0 při 260 nm odpovídá přibližně 50 µg/ml dvouvláknové DNA. Poměr absorbance při 260 nm a 280 nm (A₂₆₀/A₂₈₀) by měl být 1,6-1,9. Velikost a kvalitu DNA lze určit pomocí elektroforézy v agarózovém gelu.1 Pro rozlišení genomové DNA se osvědčil gel obsahující 0,8 % agarózu (katalogové číslo A9539) v 0,5X pufru TBE (katalogové číslo T6400). DNA lze zviditelnit obarvením interkalačním barvivem, jako je ethidium bromid (katalogové číslo E1510), a změřit ji podle známého markeru DNA, jako je Lambda DNA EcoRI Hind III digest (katalogové číslo D9281). Genomová DNA by měla migrovat jako jediný pás o vysoké molekulové hmotnosti s velmi malými známkami střihu. Přesnější určení velikosti DNA lze provést pomocí gelové elektroforézy s pulzním polem.

Průvodce řešením problémů

1. Vázací sloupec je ucpaný

Příčina - Vzorek je příliš velký.
Řešení - V budoucnu použijte méně buněk, menší kousky tkáně, menší kousky ocasu hlodavce nebo menší množství plné krve. Chcete-li zachránit současný přípravek, zvyšte gsílu a/nebo točte déle, dokud lyzát neprojde vazebnou kolonou. Výtěžnost genomové DNA může být snížena.

Příčina - Tkáň nebo ocas hlodavce jsou neúčinně rozrušeny.
Řešení - Prodlužte trávení Proteinázou K při 55 °C. Pro urychlení lýzy nakrájejte tkáň nebo ocas hlodavce na menší kousky a během trávení často míchejte, abyste zajistili účinnější lýzu. Obrácením zkumavky se vzorkem po rozkladu Proteinázou K zajistíte homogennější směs. Nepoužívejte kombinovaný roztok (roztok Proteinázy K + lyzační roztok), který byl skladován.

2. Nízký výtěžek genomové DNA

Příčina - Vzorek může být starý nebo degradovaný NEBO je tkáň neúčinně rozrušena.
Řešení - Výtěžnost se bude lišit u různých typů buněk, tkání a čerstvé plné krve. Použijte kultury před dosažením maximální hustoty nebo jakmile se stanou plně konfluentními. Tkáně nebo ocásky hlodavců sklízejte co nejrychleji. Plnou krev použijte během několika hodin. Pokud se vzorky skladují pro budoucí použití, zmrazte buňky nebo tkáně v tekutém dusíku. Plnou krev uchovávejte při teplotě 4 °C nejdéle 12 hodin.

Příčina - Směs lyzátu a ethanolu není homogenní.
Roztok - Abyste zajistili homogenní roztok, vortexujte 5-10 sekund před nanesením na vazební kolonu. Pokud je v následných aplikacích požadováno minimálně sestříhané genomové DNA, např. při použití konečného produktu pro dlouhou amplifikaci PCR, namísto vortexování promíchejte jemným pipetováním nebo inverzí do homogenní podoby.

Příčina - Směs lyzátu a ethanolu není homogenní.
Roztok - Pro zajištění homogenního roztoku vortexujte 5-10 sekund před nanesením na vazební kolonu. Pokud je v následných aplikacích požadováno minimálně sestříhané genomové DNA, např. při použití konečného produktu pro dlouhou amplifikaci PCR, namísto vortexování promíchejte jemným pipetováním nebo inverzí do homogenní podoby.

Příčina - Eluce DNA je neúplná.
Roztok - Ověřte, zda byla DNA eluována ve 200 µl elučního roztoku. Výtěžnost DNA u většiny typů materiálu lze zlepšit inkubací Elution Solution po dobu 5 minut při pokojové teplotě po jeho přidání do kolony. Lze provést druhou a třetí eluci s použitím 200 µl Elution Solution.

Příčina - Během vázání byl vynechán etanol.
Řešení - Zkontrolujte, zda byl etanol přidán v kroku 5 před nanesením vzorku na vazebnou kolonu v kroku 6. V případě, že byl etanol přidán v kroku 6, zkontrolujte, zda byl přidán v kroku 6. V případě, že byl etanol přidán v kroku 5, zkontrolujte, zda byl přidán v kroku 6.

Příčina - Eluát obsahuje zbytkový etanol z promývacího roztoku.
Řešení - Etanol z konečného promývání musí být před elucí DNA odstraněn. Otáčejte déle nebo podruhé, abyste vysušili membránu. Pokud se průtoková kapalina obsahující etanol dostane do kontaktu s vazebnou kolonou, opakujte před elucí DNA krok odstřeďování.

Příčina - Koncentrát promývacího roztoku nebyl před použitím naředěn.
Řešení - Zkontrolujte, zda byl koncentrát promývacího roztoku před použitím řádně naředěn ethanolem.

Příčina - Koncentrát promývacího roztoku nebyl před použitím naředěn.
Řešení - Zkontrolujte, zda byl Koncentrát promývacího roztoku před použitím řádně naředěn etanolem.

Příčina - DNA byla eluována vodou namísto Elution Solution.
Řešení - Pro optimální výtěžnost a skladování přečištěné DNA se doporučuje Elution Solution. Pokud se k eluci DNA používá voda, ověřte, že pH je alespoň 7,0, abyste se vyhnuli kyselým podmínkám, které mohou při dlouhodobém skladování vystavit DNA kyselé hydrolýze.

3. V případě, že se k eluci DNA používá voda, ověřte, že pH je alespoň 7,0. Čistota DNA je nižší, než se očekávalo; poměr A₂₆₀/A₂₈₀ je příliš nízký

Příčina - Vzorek byl zředěn ve vodě.
Roztok - Jako eluant použijte buď eluční roztok (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0), nebo 10 mM Tris-HCl, pH 8,0-8,5. V případě, že se jedná o eluční roztok, je třeba jej použít.

Příčina - Údaj pozadí je vysoký kvůli jemným částicím oxidu křemičitého.
Řešení - Roztočte vzorek DNA při maximální rychlosti po dobu 1 minuty; supernatant použijte k opakovanému odečtu absorbance.

4. Čistota DNA je nižší, než se očekávalo; poměr A₂₆₀/A₂₈₀ je příliš vysoký

Příčina - Genomová DNA je kontaminována RNA.
Řešenín - Do budoucích izolací zahrňte krok ošetření RNázou A nebo konečný produkt ošetřete roztokem RNázy A a přečistěte.

5. DNA je sestříhaná

Příčina - S genomickou DNA bylo nesprávně manipulováno.
Řešení - Tato souprava byla navržena tak, aby eliminovala srážení DNA a běžné kroky resuspenze, které se vyskytují v jiných soupravách pro genomovou DNA a které mohou vést ke stříhání. Všechny kroky pipetování by měly být prováděny co nejšetrněji. Doporučují se pipetovací špičky se širokým otvorem, které pomáhají eliminovat střih. Pokud je v následných aplikacích požadováno minimální stříhání genomové DNA, např, při použití konečného produktu pro dlouhou amplifikaci PCR, namísto víření promíchejte jemným pipetováním nebo inverzí až do homogenity.

Příčina - Vzorek je starý, degradovaný nebo prošel opakovanými cykly zmrazení/rozmrazení.
Řešení - Starý výchozí materiál může v eluátu poskytnout degradovanou DNA. Čerstvé buněčné a tkáňové preparáty, preparáty z ocasu hlodavců a plné krve by měly být použity okamžitě. Alternativně lze buňky a tkáně zmrazit v tekutém dusíku a uchovávat při teplotě -70 °C až do doby, než budou potřeba. Ocas hlodavce lze skladovat při -20 °C po dobu několika týdnů nebo při -70 °C po dobu několika měsíců. Celou krev lze skladovat při teplotě 4 °C po dobu až 12 hodin.

6. Následné aplikace jsou inhibovány

Příčina - Etanol se přenáší do konečného přípravku genomové DNA.
Řešení - Po závěrečném promytí vazebné kolony (krok 8) nedovolte, aby se průtoková kapalina dostala do kontaktu s kolonou. V případě potřeby po vyprázdnění sběrné zkumavky kolonu znovu roztočte na další 1 minutu při maximální rychlosti (12 000-16 000 × g).

Příčina - Do konečného přípravku genomové DNA se přenáší sůl.
Roztok - Před přidáním promývacího roztoku v kroku 8 se ujistěte, že je vazebná kolona přenesena do nové 2ml sběrné zkumavky.

Dodatek: Postup lýzy chloridem amonným pro izolaci bílých krvinek z plné krve

1. Odeberte plnou krev do zkumavky s protisrážlivou látkou.

2. Odeberte plnou krev do zkumavky s protisrážlivou látkou. Přidejte 500 µl plné krve do 1 ml lyzačního roztoku chloridu amonného*. Jemně promíchejte (převrácením nebo na stolní houpačce) při pokojové teplotě po dobu 5 minut a poté odstřeďujte po dobu 5 minut při 700 × g v mikrocentrifuze.

3. Vložte do roztoku krevní plazmy. Supernatant zlikvidujte. Pelety jemně resuspendujte v jednom dalším ml lyzačního roztoku chloridu amonného; jemně promíchejte a odstřeďte jako v kroku 2. Vyhoďte supernatant, uchovávejte buněčnou peletu na ledu a pokračujte v protokolu bílých krvinek (1e).

*Lyzační roztok chloridu amonného:
160 mM chlorid amonný (katalogové číslo A9434), 20 mM hydrogenuhličitan sodný (katalogové číslo S7277); pH na 7,2 pomocí HCl.

Materiály

Precautions and Disclaimer

Sada GenElute™ Mammalian Genomic DNA Kit je určena pouze pro laboratorní použití, nikoli pro použití v drogách, v domácnosti nebo pro jiné účely. Lyzační roztok C obsahuje chaotropní sůl, která je dráždivá. Roztok pro přípravu kolon je dráždivý. Vyhněte se kontaktu s pokožkou. Při manipulaci s těmito roztoky nebo jakýmkoli činidlem dodaným se soupravou používejte rukavice, ochranné brýle a vhodný ochranný oděv. Informace o nebezpečnosti a bezpečném zacházení naleznete v bezpečnostním listu (SDS).

Odkazy

Sambrook, et. al. J. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual,. 2nd ed.. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Birren B, Lai E. 1993. Field Inversion Gel Electrophoresis.121-128. https://doi.org/10.1016/b978-0-12-101290-8.50011-0

Chcete-li pokračovat, musíte se přihlásit.

Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.

Nemáte účet?