Lýza buněk a extrakce proteinů pro Western Blotting

Všechny kroky extrakce proteinů z buněk nebo tkání (čerstvých nebo zmrazených) je třeba provádět při teplotě 2-8 °C. Níže je uvedeno složení jednoho běžného lyzačního pufru, který se používá k přípravě proteinových vzorků. Navštivte Kalkulačky, kde najdete seznam receptur pro pufry a další roztoky pro Western blotting.

RIPA pufr pro extrakci bílkovin připravený k použití (produkt č. 1).R0278)

• NaCl (S3014) 150mM
  
• Triton X-100 (T8787) 1%
  
• Deoxycholát sodný (D6750) 0.5%
  
• SDS (74255) 0.1%
  
• Tris-HCl (T1503) pH 8.0, 50 mM

Inhibitory proteáz - neztraťte své proteiny během přípravy vzorků

Kroky protokolu extrakce proteinů

1. Vylijte médium z kultivačních misek s buňkami a promyjte buňky pomocí ledově studeného PBS.
   
2. Odstraňte PBS, přidejte ledově studený lyzační pufr.
   
3. Odstraňte buňky pomocí studené plastové buněčné škrabky. Shromážděte buňky do mikrocentrifugačních zkumavek.
   
4. Agitujte obsah v mikrocentrifugačních zkumavkách po dobu 30 min při 4 °C.
   
5. Centrifugujte zkumavky při 16 000 x g po dobu 20 min při 4 °C. Shromážděte supernatant do čerstvé zkumavky a umístěte ji na led. Pelet zlikvidujte.

Extrakce proteinů z buněk v suspenzi

1. Centrifugujte buněčnou suspenzi při 2 000 x g po dobu 5-7 min při 4 °C. Buňky se shromáždí na dně zkumavky, supernatant zlikvidujte.
   
2. K buněčné peletě přidejte ledově studený PBS a promyjte buňky odstřeďováním při 2 000 x g po dobu 5-7 min při 4 °C.
   
3. K buněčné peletě přidejte ledově studený lyzační pufr. Obsah v mikrocentrifugačních zkumavkách míchejte 30 min při 4 °C.
   
4. Centrifugujte zkumavky při 16 000 x g po dobu 20 min při 4 °C. Shromážděte supernatant do čerstvé zkumavky a umístěte ji na led. Peletku zlikvidujte.

Extrakce proteinů z tkání

1. Tkáň, která vás zajímá, rozřízněte na ledu. Přeneste tkáň do mikrocentrifugačních zkumavek s kulatým dnem a rychle ji zmrazte ponořením do kapalného dusíku.
   
2. Pro 5 mg tkáně přidejte 300 µl ledového lyzačního pufru a homogenizujte pomocí elektrického homogenizátoru. Během homogenizace přidejte dalších 300-600 µl lyzačního pufru.
   
3. Agitujte obsah po dobu 2 h při 4 °C.
   
4. Centrifugujte zkumavky při 16 000 x g po dobu 20 min při 4 °C. Shromážděte supernatant do čerstvé zkumavky a umístěte ji na led. Pelet zlikvidujte.

Normalizujte celkovou koncentraci bílkovin ve vzorcích

1. Odeberte malý objem lyzátu pro provedení testu odhadu bílkovin.
2. Stanovte koncentraci bílkovin neznámých vzorků porovnáním se standardy, přičemž zajistěte, aby byl standard naředěn do stejného pufru jako neznámé vzorky. Odhad bílkovin lze provést pomocí Coomassieho činidla pro stanovení bílkovin (produkt č. 1).27813), BCA test, absorbance při 280 nm.
3. Přeneste příslušný objem lyzátů do mikrocentrifugačních zkumavek tak, aby všechny vzorky obsahovaly stejnou celkovou koncentraci bílkovin.
   
4. Přidejte přiměřený ledově studený lyzační pufr, aby všechny lyzáty měly stejný objem.

Smíchejte vzorky s Laemmliho nakládacím pufrem

Následující složení nakládacího pufru je potřebné k přípravě vzorků pro elektroforézu.

2X Laemmliho zavaděcí pufr:

• Bromfenolová modř (produkt č.B5525) 0,004 %
• 2-merkaptoethanol 10 %
• Glycerol (Číslo výrobku G5516) 20%
• SDS (Číslo produktu 74255) 4%
• Tris-HCl (Číslo produktu T1503) 0,125 M

1. K objemu buněčného lyzátu přidejte stejný objem nakládacího pufru.
   
2. Vařte výše uvedenou směs při 95 °C po dobu 5 minut. Odstřeďujte při 16 000 x g po dobu 5 min.
   
3. Tyto vzorky lze skladovat při -20 °C nebo je lze použít k pokračování gelové elektroforézy.