Protokol o blokování kaseinového pufru

Southern Blot Postup
Western Blot Postup

Chcete-li specificky detekovat antigen imobilizovaný na pevném nosiči, je třeba zablokovat neobsazená místa na nosiči. Blokování nespecifických míst lze provést pomocí různých roztoků bílkovin a detergentů; blokovací roztok však musí být kompatibilní s detekčním systémem. Náš pufr pro blokování kaseinu je kompatibilní s řadou detekčních systémů, včetně detekčních systémů fluoresceinu a DIG.

Reagents Required

• Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 0.05% (v/v) TWEEN^® 20 (PBS-T), (Product No.P3563)
• Proteinová sonda nebo protilátka
• 0,1 M Tris, 0,1 M NaCl, pH 9,5 (pro Southern blotting)

Příprava

Rozpusťte obsah jedné nádobky kaseinového blokovacího pufru v 800 ml deionizované vody. Po rozpuštění obsahu přidejte 1000 ml deionizované vody a promíchejte.

Skladování/Skladovatelnost

Prášek skladujte při pokojové teplotě. Po rekonstituci uchovávejte kazeinový blokovací pufr při teplotě 2-8 °C, aby se zabránilo bakteriální kontaminaci. Roztoky lze po rekonstituci uchovávat až jeden týden při teplotě 2-8 °C.

Postup

Blokování southernového blotu

1. Po přenosu a zesíťování značené nukleové kyseliny na nitrocelulózovou, nylonovou nebo kladně nabitou nylonovou membránu inkubujte membránu s kaseinovým blokovacím pufrem po dobu 60 minut (0.6 ml/cm²) při pokojové teplotě nebo 30 minut při 37 °C za mírného míchání. Rovněž je třeba vzít na vědomí, že blokování lze provést přes noc při teplotě 2-8 °C.
   Poznámka: Kaseinový blokovací pufr není vhodný pro blokování PVDF membrán.
   
   
2. Membránu lze nyní sondovat fragmentem DNA podle vašeho specifického protokolu.
   
   

Postup blokování, sondování a detekce Western blotu

1. Po přenosu proteinu na nitrocelulózovou membránu inkubujte membránu 10 minut s kaseinovým blokovacím pufrem (0.6 ml/cm²) při pokojové teplotě nebo 30 minut při 37 °C za mírného míchání. Případně lze blokování provést přes noc při teplotě 2-8 °C.
   
   
2. Rozřeďte primární protilátku v kaseinovém blokovacím pufru. Běžné ředění primárních protilátek je 1:1 000, ale může se lišit. Ředění se může pohybovat od 1:100 do 1:100 000 nebo vyšší. Výzkumník musí určit optimální faktor ředění.
   
   
3. Inkubujte membránu s primární protilátkou (0,6 ml/cm²) po dobu 1-16 hodin při 2-8 °C za mírného míchání.
   
   
4. Membránu promyjte za mírného míchání 3-5krát po dobu 5 minut s PBS-T.
   
   
5. Konjugát enzymu a protilátky zřeďte v kaseinovém blokovacím pufru a inkubujte membránu 30-120 minut. Po inkubaci promyjte membránu jemným mícháním, 5-6krát po dobu 5 minut s PBS-T.
   
   
6. Membrána může být nyní vystavena chromogennímu nebo chemiluminiscenčnímu substrátu podle pokynů výrobce.

Návody pro kolorimetrickou detekci:

1. Membrána by měla být vystavena kolorimetrickému substrátu, dokud nevznikne pozitivní signál, ale jakmile se začne vytvářet pozadí, reakce by měla být zastavena. Membrána by neměla být vystavena působení substrátu déle než 60 minut.
   
   
2. U kolorimetrických peroxidázových substrátů lze reakci zastavit odstraněním substrátu a přenesením membrány do roztoku 0,1% azidu sodného s 1% SDS v PBS nebo TBS (Tris-buffered saline).
   
   U alkalicko-fosfatázových substrátů lze reakci zastavit odstraněním substrátu a přenesením membrány do roztoku 0,3 M fosforečnanu sodného o pH 5,5.

Návrhy pro chemiluminiscenční detekci:

1. Po expozici substrátu by se měl přebytečný substrát odstranit a membrána přenést na pevný nosič. Doporučuje se přenést membránu na "chránič stránek," o něco větší než samotná membrána. Podložená membrána by pak měla být umístěna do tepelně uzavíratelného sáčku. Jemným tlakem vyhlaďte vzduchové bubliny mezi membránou a plastovým sáčkem přejetím skleněné zkumavky nebo pipety přes obsaženou membránu. Sáček uzavřete a otřete přebytečný substrát z vnější strany sáčku. Umístěte obsaženou membránu do filmové kazety a exponujte ji na film.
   
   
2. Počáteční expozice by měla trvat 1 minutu; pokud však nedojde k žádnému signálu, exponujte membránu na film déle. Pokud se objeví nadměrný signál, použijte co nejkratší expozici, jak je to technicky možné. Další rady naleznete v příručce pro řešení problémů.

Návody pro detekci Western blot:

1. Redění konjugátu enzym-protilátka závisí na substrátu použitém pro následnou detekci a mělo by být optimalizováno výzkumníkem. Obecné pokyny pro ředění jsou 1:5 000 pro chromogenní substráty a 1:50 000 pro chemiluminiscenční substráty. Poměry ředění jsou založeny na počáteční koncentraci konjugátu enzym-protilátka ~1 mg/ml.
   
   
2. V citlivých systémech se projeví otisky prstů. Vždy používejte nepudrované rukavice. Vyhněte se používání kleští s hřebeny, protože ty mají také tendenci se projevovat.
   
   
3. Pokud používáte k detekci systém biotin-avidin, blokovací činidla by měla být bez biotinu. Kaseinový blokovací pufr se nedoporučuje používat v těchto systémech, protože mléko obsahuje velké a proměnlivé množství biotinu.
   
   
4. Kaseinový blokovací pufr se nedoporučuje používat v systémech detekujících fosfoproteiny kvůli přítomnosti fosforylovaných proteinů.Pro tyto systémy se doporučuje použít  želatinový blokovací pufr (č. výrobku  G7663) -.
   
   
5. Pro ověření kvality sekundární protilátky proveďte "slepou" membránu, ve které je primární protilátka vynechána. Pokud je přítomno pozadí bez primární protilátky, použijte buď jiné blokovací činidlo, nebo konjugát dále nařeďte.
   
   
6. Protilátky, které se používají k detekci antigenů, lze obvykle odstranit ponořením membrány do pufru obsahujícího 100 mM glycin, pH 2,3 po dobu 30 minut za míchání. Tento postup není univerzálně použitelný; některé antigeny jsou z membrány disociovány, takže následné sondování bude slabé nebo žádné. Mnoho výzkumníků dává přednost paralelní přípravě membrán, pokud je to možné, čímž se vyhnou nejistotě tohoto kroku "strippingu".

.

Reference pro Southern Blotting

1. Sambrook J, et al.. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, p. 9.47-9.50.

Reference pro Western Blotting

1. Bjerrum O, Heegaard N. 1988. CRC Handbook of Immunoblotting of Proteins. Second Edition. CRC Press, p. 229-236.

2. Dunba B. 1994. Protein Blotting: A Practical Approach. NY: IRL Press, p. 67-70.

3. Fortin A, Berkova N, Tremblay S, Côté F, Rousseau F, Khandjian E. 1994. A 56- to 54-kilodalton non grata signal in immunoblot analysis using the horseradish peroxidase chemiluminescence system. Biochem. Cell Biol.. 72(5-6):239-243. https://doi.org/10.1139/o94-034