Chemiluminiscenční detekce pomocí Amersham ECL, Amersham ECL Prime a Amersham ECL Select

1. Primární protilátku zřeďte v PBS-Tween nebo TBS-Tween.
   
   
2. Membránu vložte (proteinovou stranou nahoru) do roztoku primární protilátky a inkubujte za stálého míchání 1 h při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 °C. Vždy se řiďte doporučeními výrobců.
   
   
3. Membránu třikrát až šestkrát promyjte v PBS-Tween nebo TBS-Tween po dobu 5 min na jedno promytí nebo podle doporučení výrobců.
   
   
4. Membránu vložte do sekundární protilátky zředěné v PBS-Tween nebo TBS-Tween a inkubujte za míchání 1 h při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 °C.
   
   
5. Membránu vložte do promývacího roztoku a promývejte čtyřikrát až šestkrát po dobu 5 min na každé promývání.
   
   
6. Pokračujte v detekci podle doporučení pro vybrané detekční činidlo a zobrazovací systém.

Detekční systémy Amersham ECL, Amersham ECL Prime a Amersham ECL Select vyžadují k dosažení dostatečné citlivosti velmi málo protilátek; proto lze množství protilátek (primárních i sekundárních) použitých v protokolech minimalizovat. Menší množství směsí protilátek a pufru lze použít zmenšením protokolu a provedením inkubace v uzavíratelných plastových sáčcích.

Obrázek 4.4 ukazuje typické výsledky Western blotu s použitím protilátky Anti-GST.

Obrázek 4.4. Western blot lyzátů E. coli obsahujících proteiny značené GST. K detekci byla použita protilátka Anti-GST, konjugát alkalické fosfatázy proti kozímu IgG a enzymový substrát DNB/nitromodrý tetrazoliumchlorid (NBT).