Promotérský systém T7

• Co je promotorová sekvence T7?
• Vlastnosti expresního systému plazmidů T7
• MAT™ Tag Technology
• Průvodce promotorem a expresním systémem T7

 Co je  Sekvence promotoru T7?

Promotor T7 je sekvence DNA o délce 18 párů bází až po startovací místo transkripce na +1 (5' -. TAATACGACTCACTATAG - 3'), kterou rozpoznává polymeráza RNA T7¹ . Promotor T7 se běžně používá k regulaci genové exprese rekombinantních proteinů, které lze následně použít pro různé navazující výzkumné aplikace².

 Vlastnosti systému pro expresi plazmidů T7

Vlastnosti systému pro expresi plazmidů T7.Bakteriální vektory založené na promotoru T7 umožňují expresi, detekci a purifikaci rekombinantních fúzí FLAG^® a MAT™ (Metal Affinity Tag) v E. coli. Několik vektorů obsahujících promotor T7 nabízí možnosti dvojího značení pro fúzní proteiny značené značkami FLAG^® a MAT™. Tyto vektory poskytují rezistenci vůči ampicilinu pro snadnou selekci pozitivních transformantů. Vektory navíc obsahují transkripční terminátor T1T2, replikační původ pMB1 (derivát pBR322), původ f1 a gen lacI pro potlačení promotoru T7.

vektory pT7-FLAG^® a pT7-MAT™ nabízejí velmi silný promotor T7/lac. Tyto expresní vektory poskytují ještě vyšší výtěžky rekombinantních proteinů než promotorový systém tac. Promotor T7 je však známý svou expresí na pozadí ("leaky"), což může být nevýhodou, pokud jsou rekombinantní proteiny toxické pro hostitelskou buňku. Proto naše vektory obsahují sekvence lac operátoru (lacO) bezprostředně za promotorem, aby se snížila úniková exprese. Na rozdíl od promotorového systému tac musí být vektory pT7 exprimovány v hostitelích obsahujících zdroj polymerázy T7, jako jsou lyzogenní kmeny (DE3).

 MAT™ Tag Technology

Značka MAT™ neboli Metal Affinity Tag (HNHRHKH) byla vytvořena pro purifikaci rekombinantních fúzních proteinů MAT™ pomocí niklových a kobaltových afinitních gelů HIS-Select. Produkty HIS-Select umožňují vysoce selektivní purifikaci fúzních proteinů značených histidinem, jako jsou fúzní proteiny MAT™. Mnoho našich nejnovějších vektorů využívá značku MAT™, často v kombinaci se známou značkou FLAG^® . Vektory obsahující značku MAT™ jsou nabízeny ve formátech pro N-terminální nebo C-terminální značení.

Obrázek 1. Kanamycinový gen a ampicilinový gen pro větší flexibilitu selekce v E. coli

Odkazy

1. Rong M, He B, McAllister WT, Durbin RK. 1998. Promoter specificity determinants of T7 RNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95(2):515-519. https://doi.org/10.1073/pnas.95.2.515

2. Komura R, Aoki W, Motone K, Satomura A, Ueda M. High-throughput evaluation of T7 promoter variants using biased randomization and DNA barcoding. PLoS ONE. 13(5):e0196905. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0196905