Úvod do transformace kvasinek

Historie transformace a transformace u kvasinek

Kvasinky jsou eukaryotické modelové systémy pro studium, protože vykazují rychlý růst a mají rozptýlené buňky. Mají dobře definovaný genetický systém a vysoce univerzální systém transformace DNA, který lze efektivně využít pro produkci proteinů.

Transformace je proces, při kterém je do buňky vnesena exogenní DNA, což vede k dědičné změně nebo genetické modifikaci. Poprvé o tom informoval Streptococcus pneumoniae Griffith v roce 1928.¹ Princip transformace DNA prokázali Avery et al. v roce 1944.² V případě hub byly poprvé úspěšně transformovány sféroplasty poupat kvasinek Saccharomyces cerevisiae v roce 1978.³

V případě hub byly v roce 1978 poprvé úspěšně transformovány sféroplasty poupátkové kvasinky Saccharomyces cerevisiae .³ Většinu druhů kvasinek, včetně Saccharomyces cerevisiae, lze transformovat pomocí exogenní DNA v prostředí.⁴ Kvasinkové buňky se ošetřují enzymy, které rozkládají jejich buněčné stěny, čímž vznikají sféroplasty. Tyto buňky jsou velmi křehké, ale přijímají cizí DNA vysokou rychlostí.⁵ Technologie rekombinantní DNA u kvasinek se prosadila a k dispozici je množství různých vektorových konstruktů.

Transformace v buňce

Obrázek 1. Schematické znázornění transformace u kvasinek

Bylo vyvinuto několik metod transformace kvasinkových buněk (obrázek 1) ^{4, 5} Mezi běžné metody používané při transformaci kvasinkových buněk patří lithiová metoda, elektroporace, biolistická metoda a metoda skleněných kuliček. Tyto metody se běžně používají pro S. cerevisiae ale lze je použít i pro transformaci jiných hub, jako jsou kvasinky (např, Schizosaccharomycespombe, Candida albicans a Pichiapastoris) a vláknitých hub (např, Aspergillus species).

Požadavky

Metoda transformace zahrnuje tři hlavní kroky:

• Příprava kompetentních kvasinkových buněk
• Transformace pomocí plazmidové DNA
• Následné plátování pro výběr transformantů.

Přehled potřebných materiálů a podrobný protokol transformace.

Použití

Transformace se široce používá v molekulární biologii. Některé z běžných způsobů použití transformace kvasinek jsou následující:

• Transformanty kvasinek lze dále použít pro účely buněčné lýzy a přípravy plazmidů.
• Plazmidovou DNA získanou z transformantů lze poté použít jako templáty PCR nebo pro transformaci E. coli.
• Kvasinkové transformanty se používají v kvasinkových dvouhybridních systémech ke studiu interakcí protein-protein nebo protein-DNA.
• Techniky transformace kvasinek lze také použít pro komerční výrobu proteinů a enzymů.
• Používají se také v potravinářském průmyslu a v systémech likvidace rostlinného odpadu.
• Expresní systémy kvasinek určené pro syntézu a sekreci lidských proteinů (jako je interleukin-1β) mohou mít obrovský terapeutický potenciál ve farmaceutickém průmyslu.

Výpočet účinnosti transformace

Různé druhy kvasinek mají různou účinnost.⁶ Účinnost transformace je definována jako počet transformantů vzniklých na µg superzavinuté plazmidové DNA použité v transformační reakci.⁷ Většina transformačních protokolů byla vyvinuta pro pekařské kvasinky, S. cerevisiae a nemusí být ideální pro jiné druhy.

Faktory ovlivňující účinnost

Některé faktory ovlivňující účinnost transformace kvasinek jsou následující:

• Velikost DNA
• Plazmidy
• Formy DNA
• Genotyp buňky
• Růst buňky
• Typ transformace

Odkazy

1. Hinnen A, Hicks JB, Fink GR. 1978. Transformation of yeast.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75(4):1929-1933. https://doi.org/10.1073/pnas.75.4.1929

2. Griffith F. 1928. The Significance of Pneumococcal Types. J. Hyg.. 27(2):113-159. https://doi.org/10.1017/s0022172400031879

3. Avery OT, MacLeod CM, McCarty M. 1995. Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types. Mol Med. 1(4):344-365. https://doi.org/10.1007/bf03401572

4. Ito H, Fukuda Y, Murata K, Kimura A. 1983. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.. 153(1):163-168. https://doi.org/10.1128/jb.153.1.163-168.1983

5. Johnston S, Anziano P, Shark K, Sanford J, Butow R. 1988. Mitochondrial transformation in yeast by bombardment with microprojectiles. Science. 240(4858):1538-1541. https://doi.org/10.1126/science.2836954

6. Dohmen RJ, Strasser AWM, Höner CB, Hollenberg CP. 1991. An efficient transformation procedure enabling long-term storage of competent cells of various yeast genera. Yeast. 7(7):691-692. https://doi.org/10.1002/yea.320070704

7. HAYAMA Y, FUKUDA Y, KAWAI S, HASHIMOTO W, MURATA K. 2002. Extremely Simple, Rapid, and Highly Efficient Transformation Method for the Yeast Saccharomyces cerevisiae Using Glutathione and Early Log Phase Cells. J. BIOSCI. BIOENG.. 94(2):166-171. https://doi.org/10.1263/jbb.94.166