Protokoly transformace kvasinek

Úvod

Rostliny jsou považovány za modelové systémy pro studium eukaryot, protože vykazují rychlý růst a mají rozptýlené buňky. Navíc lze relativně snadno provádět replikaci a izolaci mutantních kvasinkových buněk a mají dobře definovaný genetický systém. Nejvýznamnější je, že kvasinky mají velmi univerzální systém transformace DNA, který lze účinně využít k produkci proteinů.

Přeměna zvířat

Protokol transformace kvasinek

Přehled protokolu

Metoda transformace LiAc zahrnuje tři hlavní kroky: přípravu kompetentních kvasinkových buněk, transformaci pomocí plazmidové DNA a následné plátování pro výběr transformantů. Kvasinkové transformanty se obvykle selektují pomocí auxotrofních markerů, proto se pro screening transformantů používá vhodné syntetické vysazovací médium.

Potřebná činidla:

Skladové roztoky
50 % roztok polyetylenglykolu (mol. hmotnost ~36 500)
1 M Tris-HCl a 0.2 M EDTA, pH 8,0 (TE pufr) (katalogové číslo T9285)
1 M octan lithný, pH 7.5 (katalogové číslo L4158)

1x roztok TE-LiAc
10 mM Tris-HCl, pH 8.0, s 1 mM EDTA a 0,1 M octanem lithným

Roztok TE-LiAc
40 % PEG v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, s 1 mM EDTA a 0.1 M aktetát lithný

Transformace kvasinek

1. Připravte si desky s YPD a syntetickým kompletním (SC) médiem na vysazení a autoklávujte je odděleně (Tabulky 1 a 2 ).
2. Kvasinkové buňky z destiček naočkujte do 20 ml média YPD ve sterilní baňce o objemu 100 ml.
3. Kultivace přes noc s protřepáváním.
4. Buňky z výše uvedené kultury zřeďte do 100 ml média YPD, dokud OD600 nebude 0,3
5. Buňky jemně propasírujte.
6. Resuspendujte v 7-8 ml roztoku 1x TE-LiAc a otáčejte při 23 °C po dobu 1-1.5 hodin.
7. Přidejte 10 µl 10 mg/ml DNA z lososích varlat (katalogové číslo D9156) do sterilních mikrofuge zkumavek určených pro transformaci a jedné pro negativní kontrolu.
8. Přidejte 0.1 µg kvasinkové plazmidové DNA (která má být studována) do každé zkumavky a 100 µl kompetentních buněk do každé zkumavky a poté promíchejte.
9. Přidejte 600 µl čerstvě připraveného roztoku PEG-TE-LiAc, promíchejte a inkubujte při 30 °C po dobu 30 minut s třepáním.
10. Volitelně - lze přidat DMSO (katalogové číslo D8418) na 10 % (v/v); následuje tepelný šok po dobu 15 minut při 42 °C.
11. Odstřeďujte po dobu 3 sekund, resuspendujte buňky ve sterilní vodě a vytvořte destičku s použitím vhodného média pro vysazení SC.
    

Poznámka: Viz růstové protokoly pro plátování kvasinek a následující část pro izolaci transformantů.

Izolace kvasinkových transformantů

Kvasinkové transformanty se obvykle selektují pomocí URA3 komplementační metody, ačkoli techniky využívající aminokyseliny pro komplementaci a kultivaci se mohou použít i metody, které se používají k izolaci transformantů.nbsp;blue-white-screening metody lze také použít.

Při technice selekce založené na URA3; plazmidová DNA má normální kopii kvasinkového URA3. genu a také URA3 promotor; zatímco mutantní kmen kvasinek postrádá URA3 alelu. Buňky kvasinek transformované tímto plazmidem tak mají funkční kopii genu URA3, což jim umožňuje růst na syntetickém médiu Yeast Drop-out Supplements bez uracilu (katalogové číslo Y1501).

Odkazy

1. Sherman F. 2002. Getting started with yeast.3-41. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(02)50954-x

2. MacDonald PN. 2001. Two-Hybrid Systems. https://doi.org/10.1385/1592592104

3. Treco DA, Winston F. 2008. Growth and Manipulation of Yeast. Current Protocols in Molecular Biology. 82(1): https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1302s82

4. Schiestl RH, Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16(5-6):339-346. https://doi.org/10.1007/bf00340712

5. Li B, Fields S. 1993. Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two?hybrid system. FASEB j.. 7(10):957-963. https://doi.org/10.1096/fasebj.7.10.8344494