Exprese proteinů

Proteinové expresní vektory

Expresní vektory nebo plazmidy jsou kruhové sekvence DNA, které výzkumníci běžně používají jako nástroj pro umístění genu kódujícího jejich protein. Plazmidy obsahující zájmový gen jsou následně transformovány nebo transfekovány do buněk za účelem nadměrné exprese proteinu. Plasmidy obsahují různé užitečné prvky, které usnadňují klonování, výběr klonů, expresi a čištění proteinů, mimo jiné vícenásobné klonovací místo (MCS), geny rezistence vůči antibiotikům používané pro výběr klonů, jedinečné značky pro identifikaci a čištění proteinů a silné promotorové oblasti pro řízení exprese proteinů. Existuje široká škála vektorů pro expresi proteinů, protože mnoho z těchto prvků je zaměnitelných v závislosti na specifických potřebách aplikace a typu buněk použitých pro expresi proteinů.

Bakteriální, savčí a další systémy pro expresi proteinů

Bakterie jsou díky rychlé kinetice růstu a transformaci plazmidů v E. coli během několika minut pracovním organismem pro výrobu rekombinantních proteinů. Bakteriální exprese proteinů je závislá na ribozomálních podjednotkách 30S a 50S bakteriálního ribozomu 70S. Aby se zabránilo růstu buněk bez plazmidů, používají se plazmidy obsahující geny rezistentní vůči antibiotikům jako selekční metoda k identifikaci a izolaci bakterií, které inkorporovaly plazmidy obsahující sekvenci kódující požadovaný protein. Zatímco k potvrzení přítomnosti vaší genové sekvence je často nutné další genetické sekvenování, k odstranění bakterií bez plazmidů se běžně používají četná antibiotika, která blokují syntézu bakteriálních proteinů. Kromě bakterií se pro expresi proteinů běžně používají také buněčné linie hmyzu, kvasinek a savců. Na rozdíl od bakterií však eukaryotické buněčné linie obsahují další molekulární mechanismy pro vytváření posttranslačních modifikací (např. glykosylace) a jsou často nezbytné pro funkčnost proteinů a smysluplné následné analýzy.

Použití rekombinantní exprese proteinů

Rekombinantní proteiny jsou proteiny, které jsou kódovány v plazmidu exprimujícím protein a které byly upraveny pro maximální expresi/purifikaci proteinu nebo mutovány za účelem posouzení funkce proteinu. Možnost přidat, odebrat nebo změnit sekvenci kódující protein, a to i o jediný nukleotid, poskytuje výzkumným pracovníkům nesmírně silný nástroj pro zkoumání velkého množství základních výzkumných otázek a objasnění funkce proteinu ve zdravých i nemocných tkáních. Důsledky technologie exprese rekombinantních proteinů dalece přesahují aplikace v základním výzkumu a jsou nezbytné pro vývoj život zachraňujících léčiv a vakcín.