Enzymatický test chloramfenikol acetyltransferázy

1. Cíl

Standardizovat postup stanovení enzymatického testu chloramfenikol acetyltransferázy.

2. Oblast působnosti

Tento postup se vztahuje na výrobky, které mají specifikaci enzymatické aktivity chloramfenikol acetyltransferázy.

3. Definice

3.1 Acetyl CoA - Acetylkoenzym A

3. Definice

3. Definice

3.2 CAT - chloramfenikol acetyltransferáza

3.3 CoA - koenzym A

3.4 DTNB - 5,5'-dithio-bis (kyselina 2-nitrobenzoová)

3.5 TNB - 5-Thio-2-Nitrobenzoová kyselina

3.6 Purifikovaná voda = voda z deionizačního systému, odpor > nebo = 18MΩ-cm při 25 ºC

4. Vodu z deionizačního systému, která má při teplotě 25 ºC hodnotu odporu 18MΩ-cm. Diskuse

Acetyl CoA + chloramfenikol    ^CAT   > CoA + chloramfenikol 3-acetát
CoA + DTNB       >TNB + derivát CoA
Reakce DTNB se skupinou -SH na CoA vede ke zvýšení A_412nm díky aniontu TNB.

5. Odpovědnosti

Laboranti analytických služeb by měli tento postup dodržovat tak, jak je napsán.

6. V případě, že se v laboratoři vyskytují látky, které jsou v roztoku, je nutné je odstranit. Bezpečnost

Podívejte se na bezpečnostní listy (SDS), kde jsou uvedena nebezpečí a příslušná opatření pro manipulaci.

7. V případě, že se jedná o nebezpečný materiál, je nutné jej použít. Postup

7.1 PODMÍNKY:
T = 25 °C, pH = 7,8, A_{412 nm}, dráha světla = 1 cm

7.2 METODA:
Kontinuální spektrofotometrické stanovení rychlosti

7.3 REAGENTY:

7.3.1    100 mM Tris pufr, pH 7.8 při 25 °C (pufr)
               Připravte si 12. dávku pufru.1 mg /ml roztoku báze Trizma, Číslo výrobku společnosti Sigma-Aldrich, například T1503, v čištěné vodě. Upravte pH na 7,8 při 25 °C pomocí 1N HCl.

7.3.2     2,5 mM roztok 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoové kyseliny), pH 7.8 při 25 °C (DTNB)
               Připravte si 1,5 ml.0 mg/ml roztoku DTNB, Číslo výrobku Sigma-Aldrich, například D8130, v činidle 7.3.1 (pufr).

7.3.3    5. Roztok DTNB se uchovává v pufru.0 mM roztok acetylkoenzymu A (Acetyl CoA)
               Připravte si 4. roztok acetylkoenzymu A (Acetyl CoA).68 mg/ml roztoku Acetyl CoA, sodná sůl, číslo výrobku Sigma-Aldrich, například A2056, v čištěné vodě.

7.3.4    0.3% (w/v) Chloramphenicol Solution (Substrate)
            Připravte 3 mg/ml roztok chloramfenikolu, číslo výrobku společnosti Sigma-Aldrich, například C0378, v čištěné vodě. Usnadněte rozpouštění nejprve rozpuštěním v 0,1 ml methanolu, Číslo výrobku společnosti Sigma-Aldrich, například M1775.

7.3.5    10 mM Trisův pufr, pH 7.8 při 25 °C (enzymový roztok)
               Připravte si 1 dávku.21 mg /ml roztoku báze Trizma, Číslo výrobku společnosti Sigma-Aldrich, například T1503, v čištěné vodě. Upravte pH na 7,8 při 25 °C pomocí 1N HCl.

7,3.6    Chloramphenicol Acetyltransferase Enzyme Solution (Enzyme)
            Bezprostředně před použitím připravte roztok 500 jednotek/ml chloramfenikol acetyltransferázy ve studeném činidle 7. Roztok se uchovává v chladném prostředí.3.5 (Ředidlo enzymu).

7.4 TESTOVACÍ METODA

7.4.1    Do vhodných kyvet odpipetujte ( v mililitrech) následující činidla:

7.4.2    Smíchejte inverzí a pomocí vhodného termostatovaného spektrofotometru vyrovnejte na 25 °C. Sledujte A_412nm až do konstantní hodnoty. Poté přidejte:

Přibližně po dobu 5 minut ihned promíchejte inverzí a zaznamenávejte nárůst A_412nm . Získejte ΔA_412nm /minutu s použitím maximální lineární rychlosti pro test i slepou směs.

7. Zjistěte, zda je směs v pořádku.5 VÝPOČTY

7. Zjistěte, zda je možné provést výpočty, které se vztahují k danému vzorku.5.1	Jednotky/ml enzymu =	(ΔA412nm/min Test - ΔA412nm/min Blank)(3)(df)
		(0.0136)(0.05)

 

kde:
    3 = celkový objem (v mililitrech) testu
    df = faktor ředění
     0.0136 = mikromolární extinkční koeficient pro TNB při 412 nm
    0.05 = Objem (v mililitrech) použitého enzymu

7.5,2	Jednotky/mg solid =	Jednotky/mL enzymu
		mg solid/mL enzymu

 

	Jednotky/mg bílkovin =	Units/mg solid
		mg bílkovin/mg s enzymu

 

7.6 DEFINICE JEDNOTKY
V Jedna jednotka přemění 1,0 nanomol chloramfenikolu a acetylkoenzymu A na chloramfenikol 3-acetát a koenzym A za minutu při pH 7,8 a 25 °C.

7.7 KONEČNÁ KONCENTRACE ASSAY :
V reakční směsi o objemu 3,00 ml je konečná koncentrace 94 mM Tris, 0,083 mM DTNB, 0,19 mM acetyl CoA, 0,005 % (w/v) chloramfenikolu a 25 jednotek chloramfenikol acetyltransferázy.

Odkazy

1. RS, Silverstein R. 1975. Anal. Biochem..(63):281.

2. Hash J. Methods in Enzymology. XLIII737.