Enzymatický test hyaluronidázy (3.2.1.35)

Tento postup je turbidimetrické stanovení aktivity hyaluronidázy (% transmitance při 600 nm, dráha světla = 1 cm). Je založen na následující reakci: Hyaluronidase

Kyselina hyaluronová ------------> Di a monosacharidy + menší fragmenty kyseliny hyaluronové

Definice jednotky: Jedna jednotka aktivity hyaluronidázy způsobí změnu A₆₀₀ 0,330 za minutu při pH 5,35 při 37 °C v 2,0 ml reakční směsi (45 minutový test).

Přečtěte si více informací

• Potřebné reagencie a vybavení
• .Pokyny pro přípravu
• Postup
• Výsledky

Potřebné reagencie a vybavení

• 5.0 M monobazický roztok fosforečnanu sodného (katalogové číslo 74092)
• Kyselina hyaluronová (katalogové číslo 74092)
nbsp;H7630 nebo H5388)
• 0.5 M roztok dibazického fosforečnanu sodného (katalogové číslo 94046)
• 5.0 M roztok chloridu sodného (katalogové číslo S6546)
• Hovězí sérový albumin (katalogové číslo A4503)
• Octan sodný (katalogové číslo A4503)
nbsp;S8625)
• Kyselina octová (katalogové číslo 695092)
• Kuvety

Předběžná opatrnost: Informace o nebezpečnosti a bezpečném zacházení naleznete v bezpečnostním listu.

Pokyny pro přípravu

Pro přípravu činidel použijte ultračistou vodu (odpor ≥18 MΩ×cm při 25 °C).

Fosfátový pufr (300 mM fosforečnan sodný, pH 5,35 při 37 °C) - Připravte si ředění 1:16,7 s použitím 5. Fosfátu sodného.0 M monobazického roztoku fosforečnanu sodného (katalogové číslo 74092) v ultračisté vodě. Upravte pH na 5,35 při 37 °C pomocí 1 M NaOH nebo 1 M HCl.

Roztok kyseliny hyaluronové [0,03% (w/v)]

1. Připravte si 0,03% (w/v) roztok kyseliny hyaluronové.3 mg/ml roztoku ve fosfátovém pufru s použitím kyseliny hyaluronové (katalogové číslo H7630 nebo H5388).
2. Roztok zahřejte na 90-95 °C za stálého míchání, dokud se kyselina hyaluronová nerozpustí. K úplnému rozpuštění tohoto materiálu je zapotřebí patnáct až třicet minut zahřívání a míchání. Neprovádějte vaření.
3. Po rozpuštění nechte roztok vychladnout na 37 °C ve vodní lázni. Roztok upravte na původní objem pomocí ultračisté vody. Upravte pH na 5,35 při 37 °C pomocí 1 M NaOH nebo 1 M HCl.

Enzymový roztok [20 mM fosforečnan sodný se 77 mM chloridu sodného a 0,01% (w/v) hovězího sérového albuminu, pH 7.0 při 37 °C] - Pro přípravu 200 ml:

1. Přidejte 8,46 ml 0.2 M monobazického fosforečnanu sodného (připraveného pomocí katalogového čísla 74092 v ultračisté vodě).
2. Přidejte 11,54 ml 0.2 M fosforečnan sodný dvojmocný (připravený s použitím katalogového čísla 94046 v ultračisté vodě.
3. Přidá se 3,08 ml 5,0 M roztoku chloridu sodného (katalogové číslo S6546).
4. Přidejte 20 mg hovězího sérového albuminu (katalogové číslo A4503).
5. Přidejte ultračistou vodu, abyste doplnili konečný objem.
6. Upravte pH na 7.0 při 37 °C pomocí 1 M NaOH nebo 1 M HCl.

Kyselý roztok albuminu [24 mM octanu sodného, 79 mM kyseliny octové s 0,1% (w/v) hovězího sérového albuminu, pH 3.75 při 25 °C] - Pro přípravu 150 ml:

1. Přidejte 3,6 ml zásobního 1,0 M octanu sodného, pH 4.8, roztok (připravený pomocí katalogového čísla S8625).
2. Přidejte 0,5 ml roztoku kyseliny octové.68 ml kyseliny octové (katalogové číslo 695092).
3. Přidejte 150 mg hovězího sérového albuminu (katalogové číslo A4503).
4. Přidejte ultračistou vodu na doplnění konečného objemu.
5. Při teplotě 25 °C upravte pH na 3,75 pomocí 5 M HCl.

Roztok enzymu (hyaluronidáza)

Bezprostředně před použitím připravte zásobní roztok enzymu o koncentraci 1 000 jednotek/ml ve studeném enzymovém ředidle. Zřeďte zásobní roztok enzymu studeným Enzyme Diluent, abyste získali pracovní roztok o koncentraci ~6 jednotek/ml.

Postup

Konečné koncentrace testu

V reakční směsi o objemu 2,0 ml jsou konečné koncentrace 0.015% (w/v) kyseliny hyaluronové, 150 mM fosforečnanu sodného a 2-5 jednotek hyaluronidázy.

Poznámka: Všechny testy a slepé pokusy rozložte nejméně o 30 sekund tak, aby byl dostatek času na promíchání každého testu a slepého pokusu inverzí před inkubací při pokojové teplotě.

1. Do vhodných nádobek odpipetujte následující činidla:

2. Promíchejte vířením a stabilizujte na 37 °C po dobu 10 minut. Poté přidejte:

3. Ihned promíchejte vířením a inkubujte při 37 °C po dobu přesně 45 minut.  

4. Po 45 minutách přeneste 0.5 ml každého testu a slepého pokusu do vhodných kyvet obsahujících 2,5 ml kyselého roztoku albuminu
    a ihned promíchejte obrácením.  

5. Kuchyně se rozdělí na dvě části. Každou kyvetu nechte stát 10 minut při pokojové teplotě.
   Poznámka: Pokud inkubace netrvá přesně 10 minut, výsledky se výrazně změní.

6. Stanovte % transmitance při vlnové délce 600 nm.

• Spektrofotometr vynulujte proti slepému vzorku. Odečtěte % transmitance pro zkoušky a slepý pokus.
  Poznámka: Při společném dávkování vzorků vyčistěte spektrofotometr proti příslušným připraveným slepým roztokům.  
• Nekorektní % transmitance pro každou zkoušku musí být v rozmezí 130-170 %. Pro výpočet aktivity je zapotřebí minimálně tři platné hodnoty pro každý Test.
  Poznámka: Koncentraci roztoku enzymu lze upravit tak, aby bylo dosaženo výsledků v platném rozsahu % transmitance.

Výsledky

Výpočty

1.

                                                   nbsp;                   (%T Test - %T Blank) (df)
Jednotky/mL enzym =  -----------------------------------------------
                                                    (14.).84) (ml roztoku enzymu)

kde:
df = faktor ředění enzymu
14,84 = koeficient extinkce stanovený společností Sigma-Aldrich
ml roztoku enzymu = objem roztoku enzymu použitý v reakci

2.