Standardní protokol PCR

Jak provést PCR

Standardní nastavení polymerázové řetězové reakce (PCR) se skládá ze čtyř kroků:

1. Přidejte požadované reagencie nebo mastermix a templát do zkumavek pro PCR.
2. Smíchejte a odstřeďte.
   *Přidejte minerální olej, abyste zabránili odpařování v termocykleru bez vyhřívaného víka.
3. Amplifikujte podle parametrů termocykleru a primerů.
4. Vyhodnoťte amplifikovanou DNA elektroforézou v agarózovém gelu s následným barvením ethidiumbromidem.

Tyto kroky jsou podrobněji popsány níže spolu s tipy pro výběr materiálů a činidel. Jedná se o základní protokol PCR s použitím Taq DNA polymerázy.

Kroky PCR a základní komponenty PCR

Problémy s reakcí PCR zahrnují mnoho faktorů. Podívejte se na tuto animaci a zjistěte, jak výběr správných komponent a podmínek cyklování pro vaše potřeby může pomoci dosáhnout optimálních výsledků.

Další protokoly pro jiné polymerázy nebo pokročilé techniky PCR najdete v Protokoly v našem Průvodci technologiemi PCR.

Více informací o standardní PCR, včetně toho, co to je, najdete na naší Stránka Základy PCR.

Reagenty:

: Co je potřeba pro PCR?

Co je to Taq polymeráza?

Taq DNA polymeráza je termostabilní enzym pocházející z termofilní bakterie Thermus aquaticus. Běžně se používá  k amplifikaci fragmentů DNA při PCR. Enzym je v rekombinantní formě, exprimovaný v E. coli. Je schopen vydržet opakované zahřívání na 95 °C (jak to vyžaduje technika PCR) bez výrazné ztráty aktivity. Enzym má molekulovou hmotnost přibližně 94 kDa podle SDS-PAGE bez detekovatelné endonukleázové nebo exonukleázové aktivity. Má 5'→3' DNA polymerázovou aktivitu a 5'→3' exonukleázovou aktivitu. Každá šarže Taq DNA polymerázy je testována pro amplifikaci PCR a dvouřetězcové sekvenování. Enzym se dodává v množství 5 jednotek/µl a je dodáván s optimalizovaným 10x reakčním pufrem.

Standardní Taq <./i>DNA polymeráza

Pomocí níže uvedené tabulky vyberte vhodnou směs Taq DNA polymerázy pro podmínky vaší reakce. Vyberte si z čirých nebo červeně zbarvených přípravků s chloridem hořečnatým (MgCl₂) a bez něj nebo z předem připravené readymixové nebo master mixu s pufrem a dNTP.

Definice jednotky: Jedna jednotka inkorporuje 10 nmol celkového množství deoxyribonukleosidtrifosfátů do kyselé vysrážené DNA za 30 minut při 74 °C.

Postup: Kroky PCR

Optimální podmínky pro koncentraci Taq polymerázy DNA, templátové DNA, primerů a MgCl₂ závisí na použitém systému. Může být nutné stanovit optimální podmínky pro každou jednotlivou složku. To platí zejména pro Taq DNA polymerázu, parametry cyklu a koncentraci MgCl₂. Doporučuje se enzym a MgCl₂ titrovat za účelem stanovení optimální účinnosti.

1. Přidejte činidla do zkumavky vhodné velikosti v pořadí uvedeném v tabulce. (Zvolte příslušnou tabulku pro nastavení reakce: standardní nebo readymix činidla.) Pro velký počet reakcí by měla být nastavena mastermix bez šablony a alikvotována do reakčních zkumavek. Na konci by měla být do příslušných zkumavek přidána šablona.
   

Standardní reakce PCR

*Kupte pufr a Taq polymerázu společně: D1806, D4309 nebo D4545

Readymix PCR reakce

2. Mírně promíchejte vortexem a krátce odstřeďte, aby se všechny složky shromáždily na dně zkumavky.

Poznámka: Pokud používáte termální cyklér bez vyhřívaného víka, přidejte do horní části každé zkumavky 50 µl minerálního oleje, abyste zabránili odpařování.

3. Amplifikace. Parametry amplifikace se liší v závislosti na použitých primerech a termálním cykleru. Může být nutné optimalizovat systém pro jednotlivé primery, templát a termální cyklér.

Typické parametry amplifikace

Doporučuje se 25-30 cyklů amplifikace.

4. Amplifikovanou DNA lze vyhodnotit pomocí Agarosová gelová elektroforéza a následné barvení ethidium bromidem.

      Poznámka: Překrytí minerálním olejem lze odstranit jednorázovou extrakcí chloroformem (1:1), čímž se získá vodná fáze.

Reagencie pro elektroforézu nukleových kyselin

• Agarosa  (prefabrikované gely, prášek atd.)
• Pufr jako je MOPS-EDTA-acetát sodný, tris-acetát-EDTA (TAE) nebo tris-borát-EDTA (TBE)
• Roztok pro nakládání gelu a pufr pro nakládání vzorku RNA
• Elektroforetické barvivo nebo barvivo jako je ethidium bromid

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Licenční prohlášení k etiketě

UPOZORNĚNÍ PRO KUPCE: VYHLÁŠENÍ O LICENCI

S nákupem tohoto výrobku není předávána žádná licence podle některého z amerických patentů č. 5,804,375, 5,994,056, 6,171,785, 6,214,979, 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787 a 6,258,569 a odpovídajících patentů mimo území Spojených států amerických nebo jakýchkoli jiných patentů či patentových přihlášek, které se týkají postupů 5' nukleázy a dsDNA-vázání barviva. Pro další informace kontaktujte ředitele licencí, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA