Aplikace polymerázové řetězové reakce (PCR)
Polymerázová řetězová reakce (PCR) je výkonná základní technika molekulární biologie, která je účinnou a rychlou in vitro metodou pro enzymatickou amplifikaci specifických sekvencí DNA nebo RNA z různých zdrojů. Standardní PCR se skládá z cílové DNA, sady syntetických oligonukleotidových primerů, které obklopují cílovou sekvenci DNA, termostabilní DNA polymerázy (obvykle Taq polymerázy) a nukleotidů. Při použití termálních cyklérů probíhají během každého amplifikačního cyklu tři fáze, včetně denaturace dvouřetězcové DNA (dsDNA) na samostatnou jednovláknovou DNA, žíhání primerů na cílovou sekvenci DNA a extenze, kdy DNA polymeráza prodlužuje DNA z primerů a vytváří novou dsDNA s jedním starým a jedním novým vláknem. Vlákna syntetizovaná v jednom cyklu slouží jako předloha v dalším cyklu, což vede k milionnásobnému nárůstu množství DNA během pouhých 20 cyklů.
Doporučené kategorie
Molekulární klonování a metody exprese proteinů a protokoly pro spolehlivé klonování a robustní expresi proteinů z hmyzích, bakteriálních a savčích expresních vektorů.
Epigenetická činidla a zdroje pro zkoumání druhů RNA, metylace DNA, modifikací chromatinu a histonů.
Komplexní analýza střevního mikrobiomu: Odhalte komplexní řešení zahrnující přípravu vzorků, sekvenování, bioinformatiku a statistiku. Od 16S po WGS.
Reverzní transkriptázová PCR (RT-PCR)
RT-PCR neboli reverzní transkriptázová PCR je varianta standardní techniky PCR, která zahrnuje amplifikaci specifické mRNA získané z velmi malých vzorků. Eliminuje potřebu zdlouhavého procesu čištění mRNA, který je vyžadován u běžných technik klonování. Při RT-PCR se kromě standardních činidel pro PCR používá reverzní transkriptáza a vzorek RNA. Reakční směs se zahřeje na 37 ˚C, což umožní vytvoření komplementární kopie cDNA ze vzorku RNA pomocí reverzní transkriptázy. Tato cDNA se pak annealizuje na jeden z primerů, což vede k syntéze prvního vlákna. Poté následuje standardní PCR, při níž se nakonec vytvoří dsDNA. RT-PCR se často kombinuje s PCR v reálném čase (qPCR), která se hojně využívá ke kvantifikaci hladin transkriptů v buňkách a tkáních.
Hot Start PCR
Hot Start PCR je technologie, která inhibuje horký start Taq polymerázy nebo inkorporaci modifikovaných dNTP během nastavení reakce, dokud nedojde ke kroku tepelné aktivace. K zastavení aktivity polymerázy s horkým startem jsou k dispozici různé metody, mezi něž patří chemická modifikace, metody zprostředkované protilátkami a metody zprostředkované aptamerem.
Endpoint PCR pro dlouhou a přesnou amplifikaci cílů
Endpoint PCR se často používá ke zjištění přítomnosti cílů a jejich relativního množství po dokončení reakce. Omezená délka sekvencí vznikajících při standardní PCR, přibližně 5 kb, je částečně překonána začleněním dalších faktorů, které zajišťují "proofreading" aktivitu. Dlouhá a přesná (LA) PCR zahrnuje použití druhé termostabilní polymerázy s 3′→5′ exonukleázou k opravě terminálních chybných nukleotidů, což vede k výrazně zvýšené věrnosti a schopnosti amplifikovat cíle DNA o délce až 40 kb.
Vyhledejte v našem vyhledávači dokumentů datové listy, certifikáty a technickou dokumentaci.
Související články
- Problémy s PCR a RT-PCR jsou identifikovány během analýzy gelovou elektroforézou, jako je absence pásů, přítomnost nespecifických zákazů, nadměrné rozmazání a rozmazání pásů.
- Digital PCR is an end-point PCR method that is used for absolute quantification and for analysis of minority sequences against a background of similar majority sequences, e.g., quantification of somatic mutations.
- Ethidium bromid je dobře známé a široce používané fluorescenční barvivo v biotechnologickém výzkumu.
- Polymerázová řetězová reakce je jednou z nejpoužívanějších technik v molekulární biologii. Proces PCR se skládá ze tří hlavních kroků: denaturace, žíhání a extenze.
- The purpose of Hot Start PCR is to inhibit the PCR reaction in order to reduce nonspecific amplification, prevent the formation of primer dimers, and increase product yields.
- Zobrazit vše (92)
Související protokoly
- Naučte se standardní kroky protokolu PCR a zkontrolujte seznamy činidel nebo parametry cyklování. Tato metoda pro rutinní amplifikaci DNA pomocí PCR používá standardní Taq DNA polymerázu.
- Žíhání je proces zahřívání a ochlazování dvou jednořetězcových oligonukleotidů s komplementárními sekvencemi.
- Seznamte se s metodami výpočtu teploty tání oligonukleotidů (Tm).
- Variabilita pracovního postupu PCR je ovlivněna zdrojem vzorku, reverzní transkripcí a návrhem testu, což má dopad na reprodukovatelnost.
- The exrract-N-Amp kit protocol provides a rapid DNA extraction method that leads to a PCR-ready sample in 15 minutes. Optimized PCR ReadyMix yields successful and clean amplification. RED loading dye allows for sample tracking.
- Zobrazit vše (85)
Další články a protokoly
Jak vám můžeme pomoci
V případě jakýchkoli dotazů odešlete žádost o zákaznickou podporu
nebo se obraťte na náš tým zákaznického servisu:
Pište custserv@sial.com
nebo volejte na +1 (800) 244-1173
Další podpora
- Chromatogram Search
Use the Chromatogram Search to identify unknown compounds in your sample.
- Kalkulačky a aplikace
Web Toolbox - vědecké výzkumné nástroje a zdroje pro analytickou chemii, vědu o živé přírodě, chemickou syntézu a materiálovou vědu.
- Customer Support Request
Customer support including help with orders, products, accounts, and website technical issues.
- FAQ
Explore our Frequently Asked Questions for answers to commonly asked questions about our products and services.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?