Protokol o digesci restrikčních enzymů

Naše kolekce restrikčních enzymů byla optimalizována pro trávení pomocí pěti jedinečných pufrů. Při štěpení DNA pomocí jednoho enzymu použijte pufr dodávaný s enzymem.

Protokol pro digesci DNA pomocí jednoho restrikčního enzymu

1. Přidejte komponenty do čisté zkumavky v uvedeném pořadí:
         1 µl DNA (koncentrace 1 µg/µl)
   .      2 µL 10x buffer
        1 µl restrikčního enzymu
        16 µl sterilní vody
   
2. Inkubujte reakci při teplotě trávení (obvykle 37 °C) po dobu 1 hodiny.
3. Trávení zastavte tepelnou inaktivací (65 °C po dobu 15 minut) nebo přidáním 10 mM EDTA konečné koncentrace.
4. Trávená DNA je připravena k použití ve výzkumných aplikacích.

Při použití dvou restrikčních enzymů najednou nejprve zkontrolujte aktivity enzymů v jednotlivých pufrech pomocí tabulky na Referenčním materiálu pufrů restrikčních enzymů. Pokud mají oba enzymy 100% aktivitu ve stejném pufru, můžete pokračovat v protokolu dvojité digesce s použitím tohoto pufru. Případně můžete optimální pufr určit z tabulky běžných dvojitých štěpení. V některých případech se doporučuje sekvenční trávení z důvodu nekompatibility pufrů (složení nebo teplota).

Protokol digesce DNA pomocí dvou restrikčních enzymů

1. Přidejte komponenty do čisté zkumavky v uvedeném pořadí:
         1 µl DNA (koncentrace 1 µg/µl)
   .      2 µL 10x buffer
        1 µl každého restrikčního enzymu
        15 µl sterilní vody
   
2. Inkubujte reakci při teplotě trávení (obvykle 37 °C) po dobu 1 hodiny.
3. Trávení zastavte tepelnou inaktivací (65 °C po dobu 15 minut) nebo přidáním 10 mM EDTA konečné koncentrace.
4. Trávená DNA je připravena k použití ve výzkumných aplikacích.

Protokol sekvenční digesce DNA

1. Přidejte komponenty do čisté zkumavky v uvedeném pořadí:
         1 µl DNA (koncentrace 1 µg/µl)
        2 µl 10x pufru
              2 µl 10x pufrunbsp; 1 µl restrikčního enzymu
        16 µl sterilní vody
   
2. Inkubujte reakci při teplotě trávení (obvykle 37 °C) po dobu 1 hodiny.
3. Rozklad zastavte tepelnou inaktivací (65 °C po dobu 15 minut) nebo přidáním 10 mM konečné koncentrace EDTA.
4. Znovu získejte DNA pomocí purifikační soupravy: znovu suspendujte a nařeďte DNA na 1 µg/µl.
5. Připravte druhý rozklad podle kroku 1. Pokračujte krokem 3.
6. Trávená DNA je připravena k použití ve výzkumných aplikacích.