Wpływ dodatków do fazy ruchomej na czułość LC-MS, zademonstrowany przy użyciu kannabinoidów Spice
Xiaoning Lu, Craig Aurand, David, S Bell
Reporter US, Volume 30.3
W artykule podkreślono znaczenie stosowania najwyższej jakości rozpuszczalników i odczynników, wraz z wysokowydajnymi kolumnami HPLC i skutecznymi metodami przygotowania próbek, w celu uzyskania najlepszych danych MS.
Czytaj więcej
Wprowadzenie
Część 1 naszych Tematów w LC-MS, opublikowanych w Reporterze 30.2, dotyczyła wykorzystania selektywności kolumn w opracowywaniu niezawodnych metod LC-MS1. Część 2 analizuje ważną rolę składników fazy ruchomej, w szczególności modyfikatorów jonowych. W tym artykule przedstawiono optymalizację LC-MS/MS do analizy kannabinoidów przyprawowych przy użyciu szeregu dodatków do fazy ruchomej w celu zwiększenia odpowiedzi analitu i selektywności. Czterostronne podejście wykorzystujące selektywność kolumny HPLC, czystość rozpuszczalnika, skuteczne przygotowanie próbki i wzorce referencyjne, zostało wykorzystane do opracowania metody szybkiej izolacji i identyfikacji kannabinoidów przyprawowych z osocza.
Tło
Zoptymalizowane fazy ruchome dla metod LC-UV niekoniecznie można przenieść do metod wykorzystujących detekcję MS. Zwykle przy opracowywaniu metod LC-UV głównym celem jest osiągnięcie odpowiedniej retencji i rozdzielczości analitów przy jednoczesnym utrzymaniu niskiego tła UV. Jednak w przypadku metod LC wykorzystujących detekcję jonizacji metodą elektrorozpylania (ESI) należy wziąć pod uwagę nie tylko retencję i rozdzielczość, ale także wpływ składników fazy ruchomej na jonizację. Składniki fazy ruchomej LC-ESI muszą być również lotne, aby były skutecznie odparowywane w źródle ESI wlotu MS i wolne od zanieczyszczeń, które mogą przyczyniać się do tła, zmniejszać czułość poprzez tworzenie adduktów lub w inny sposób wpływać na czułość i ogólną jakość eksperymentu MS. Typowe modyfikatory fazy ruchomej stosowane w LC-MS obejmują bufory mrówczanu amonu i octanu amonu oraz kwasy mrówkowy, octowy i trifluorooctowy.
Spice Cannabinoids: Aktualne zainteresowanie analityczne
Syntetyczne kannabinoidy (Spice, Rysunek 1) są stosunkowo nowym rodzajem narkotyku używanego jako pseudo-legalny środek do uzyskania haju typu marihuany2. Na początku 2011 r. amerykańska Agencja ds. Walki z Narkotykami (DEA) umieściła kilka najpopularniejszych syntetycznych kannabinoidów, takich jak JWH-018 i JWH-073, na liście Schedule 1, czyniąc posiadanie lub spożywanie tych związków nielegalnym. Jednak nowe syntetyczne kannabinoidy są stale wprowadzane, ponieważ dostawcy dostosowują struktury molekularne. Zdolność do szybkiej i niezawodnej identyfikacji stale zmieniającej się populacji tych związków we krwi lub moczu podejrzanych użytkowników jest poważnym wyzwaniem analitycznym, przed którym stoją chemicy sądowi.
Rysunek 1. Reprezentatywne związki przypraw
Badanie wpływu modyfikatora jonowego fazy ruchomej na sygnał MS
Rozwój metody obejmował badanie różnych faz Ascentis® Express. Faza Ascentis Express F5 zapewniła najlepszą rozdzielczość pięciu kannabinoidów w warunkach izokratycznych. Dlatego też została ona wykorzystana do eksperymentów w celu określenia, które modyfikatory fazy ruchomej umożliwiły najwyższą odpowiedź ESI-MS dla pięciu kannabinoidów przyprawowych. Fazy ruchome składające się z 5 mM octanu amonu, 5 mM mrówczanu amonu, 0,05% kwasu octowego lub 0,05% kwasu mrówkowego w stosunku 50:50 woda:acetonitryl zostały ocenione pod kątem rozdzielczości chromatograficznej wraz z odpowiedzią ESI-MS.
Impact of Solvents and Additives on Resolution and Relative Response
Rysunek 2 przedstawia wynikowe chromatogramy z badania dodatków. Rozdzielczość pięciu związków uzyskano w każdych z czterech testowanych warunków. Kolejności elucji były porównywalne z wyjątkiem jednego związku, JWH-200, który miał dłuższą retencję w warunkach kwaśnych. (Jest to prawdopodobnie spowodowane znanym charakterem jonowymiennym F5 i zasadowym charakterem morfolinowej grupy funkcyjnej JWH-200). Konieczne są dalsze eksperymenty, aby w pełni wyjaśnić mechanizm retencji).
| Kolumna: | Ascentis Express F5, 5 cm x 2,1 mm, 2,7 µm (Nr produktu. 53567-U) |
| faza ruchoma: | (50:50) acetonitryl:woda zawierająca różne dodatki jonowe, jak pokazano na rysunku |
| prędkość przepływu: | 0.3 mL/min |
| temp. | 35 °C |
| ciśnienie (kolumna): | 1296 psi (89.4 bar) |
| detektor: | MS, ESI(+), MRM, m/z 344/155 (metabolit JWH-073), 385/155 (JWH-200), 336/121 (JWH-250), 328/155 (JWH-073) i 342/155 (JWH-018) |
| wstrzyknięcie: | 2 µL |
| próbka: | 5 ng/ml każdego związku w 50/50 woda:metanol |
| system: | Agilent 1100 HPLC, 3200 QTRAP (AB/Sciex) |
Rysunek 2.Rozdzielczość LC-MS/MS i reakcja kannabinoidów Spice z różnymi jonowymi dodatkami fazy ruchomej
Odnosząc się do odpowiedzi analitu, systemy mrówczanowe dały wyższą odpowiedź analitu niż systemy octanowe, przy czym warunki mrówczanu amonu dały ogólnie najlepsze wyniki, gdy wzięto pod uwagę retencję JWH-200 (Tabela 1). Chociaż koelucja nie stanowiła problemu w tym przykładzie; w przypadku separacji LC-MS ogólnie zaleca się wybór metody opartej na odpowiedzi analitu, a nie rozdzielczości chromatograficznej, gdy anality są łatwo rozróżniane przez specyficzne przejścia MS/MS, jak ma to miejsce w przypadku tych związków przyprawowych.
Tworzenie adduktów i czystość rozpuszczalnika
Tworzenie adduktów jest również ważnym czynnikiem podczas optymalizacji metod LC-MS pod kątem czułości. Tworzenie adduktów docelowego analitu, głównie z sodem i potasem w ESI(+), może poświęcić tworzenie docelowych protonowanych jonów analitu, zmniejszając w ten sposób ogólną czułość metody i komplikując widmo. Wcześniejsze badania szczegółowo omawiały zjawisko tworzenia adduktów, podkreślając znaczenie stosowania rozpuszczalników i dodatków do eluentów, które są wolne od niepożądanych jonów3.
Analiza związków przypraw w próbkach osocza
Zoptymalizowana metoda MS na standardach została następnie wykorzystana na próbce osocza z domieszką. Endogenne białka i fosfolipidy zostały najpierw usunięte przy użyciu HybridSPE®- Phospholipid. Szczegóły dotyczące metody przygotowania próbki i mechanizmu działania HybridSPE-Phospholipid można znaleźć w odniesieniu 4. Rysunek 3 przedstawia wynikowy chromatogram LC-MS/MS pięciu związków przypraw wyekstrahowanych z osocza i rozdzielonych na kolumnie Ascentis Express F5.
Rysunek 3. Analiza LC-MS/MS związków przypraw z osocza na urządzeniu Ascentis Express F5 po SPE z użyciem HybridSPE-fosfolipidów
Podsumowanie
Podczas optymalizacji metod LC-MS należy zwrócić szczególną uwagę na składniki fazy ruchomej. Wykorzystując społecznie problematyczne kannabinoidy przyprawowe jako przypadek testowy, opisane tutaj badanie pokazuje wpływ różnych modyfikatorów fazy ruchomej na separację, przy czym modyfikatory mrówczanowe przewyższają octanowe pod względem sygnałów MS (lub czułości) i rozdzielczości chromatograficznej. Badanie to jest doskonałym przykładem korzyści płynących ze stosowania rozpuszczalników o wysokiej czystości z 96-dołkowymi płytkami HybridSPE-Phospholipid do skutecznego oczyszczania próbek, kolumnami Ascentis Express UHPLC do szybkich i wydajnych separacji oraz wzorcami Cerilliant do niezawodnej charakterystyki i kwantyfikacji analitów w matrycach biologicznych.
Conclusion
Na podstawie tych wyników można stwierdzić, że ten protokół SPE wykorzystujący 96-dołkowe płytki HybridSPE-Phospholipid, a następnie LC-MS/MS jest przydatny do globalnej analizy metabolomu poprzez frakcjonowanie, tutaj na metabolity inne niż PL i PL. W związku z tym zademonstrowano wielozadaniowe zastosowanie produktów HybridSPE-Phospholipid powszechnie stosowanych do usuwania zakłóceń.
Pełne szczegóły dotyczące tych badań oraz PL wykrytych i potwierdzonych przez MS/MS można znaleźć w reference.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?