Koktejl inhibitorů fosfatázy

Ian Gleiser, Pnina Yaish, Efrat Barnea-Gedalyahu, Dorit Zharhary

Úvod

Fosforylace je reverzibilní posttranslační modifikace proteinů. Proteinkinázy katalyzují přenos záporně nabité γ-fosfátové skupiny z ATP na hydroxylový postranní řetězec serinových, treoninových nebo tyrosinových zbytků proteinu, čímž se mění konformace a aktivita proteinu. Opačnou reakci, odstranění fosfátu z proteinu neboli defosforylaci, provádějí proteinové fosfatázy.^1,2 Tři až čtyři procenta savčích proteinů jsou kinázy a fosfatázy, některé jsou specifické pro několik cílových proteinů, zatímco jiné působí široce na mnoho proteinů. 

Fosforylace proteinů je klíčovým regulačním mechanismem, který řídí aktivitu, interakce, lokalizaci a degradaci proteinů. Řídí procesy přenosu signálu, buněčného cyklu, apoptózy, metabolismu a další. Asi třetina proteinů přítomných v typické savčí buňce je fosforylována, mnohé z nich na více místech. Serinová fosforylace tvoří 86 % fosfoproteomu, zatímco threoninová a tyrosinová fosforylace 12 %, resp. 2 %. Řada lidských onemocnění je spojena s abnormální fosforylací buněčných proteinů.^3-5

Využití fosforylace/defosforylace proteinu jako kontrolního mechanismu má pro buňku mnoho výhod. Je rychlá, nevyžaduje syntézu nových proteinů ani degradaci proteinů a jedná se o reverzibilní reakci.

Při studiu buněčných procesů zahrnujících fosforylaci proteinů, jako jsou signální kaskády a interakce protein-protein, nebo při analýze fosforylovaných míst na proteinu a purifikaci fosfoproteinu je nezbytné inhibovat buněčné proteinové fosfatázy inhibitory fosfatáz. To umožňuje zmrazení fosforylačního stavu cílového proteinu/proteinů ve zvoleném časovém okamžiku. Fosforylační databáze www.phosphosite.org uvádí 80 000 fosforylačních míst. Detekce většiny z nich by nebyla možná bez použití inhibitorů fosfatáz.

Proteinové fosfatázy

Proteinové fosfatázy se dělí do podkategorií na základě jejich substrátové specifity (Tabulka 1).

1. Alkalická fosfatáza^6-8  - Rodina nespecifických fosfatáz, která je zodpovědná za odstraňování fosfátových skupin z mnoha typů molekul, včetně proteinů, nukleotidů a alkaloidů. Izoenzymy alkalické fosfatázy savců jsou inhibovány analogy homoargininu a levamisolu. Střevní a placentární izoenzymy však levamizol neinhibuje, ale inhibuje je imidazol.
2. Proteinová serin/treonin fosfatáza^9,10 - Tato třída fosfoproteinových fosfatáz představuje většinu aktivity Ser/Thr fosfatáz in vivo. Zahrnuje dvě hlavní podtřídy, PP1 a PP2. Ta se dále dělí na základě požadavků na kovové ionty: PP2A, která nevyžaduje ionty kovů, PP2B, která je stimulována vápníkem, a PP2C, která je závislá na Mg²⁺ . Ser/Thr fosfatázy jsou inhibovány mnoha malými molekulami z mořských hub, půdních streptomycet a dalších. Nejznámějšími jsou kyselina okadaová, kalikulin A, microcystin-LR, tautomycin, fostriecin a kantaridin. Aktivity těchto sloučenin mají různou specifitu vůči různým Ser/Thr fosfatázám.¹¹
3. Protein tyrosin fosfatáza¹² - Skupina enzymů, které odstraňují fosfátové skupiny z fosforylovaných tyrosinových zbytků na bílkovinách pomocí enzymového meziproduktu cysteinylfosfátu. Tyto enzymy jsou klíčovými regulačními složkami v signálních transdukčních drahách. Tyrozinfosfatázy jsou inhibovány ortovanadátem a příbuznými sloučeninami a fluoridem sodným.
4. Dvojspecifické (Tyr a Ser/Thr) fosfatázy³ - Dvojspecifické fosfatázy jsou podtřídou proteinových tyrozinfosfatáz, které jsou schopny defosforylovat také serinové a threoninové zbytky. Podílejí se na regulaci klíčových buněčných signálních drah. Konkrétní příklady těchto inhibitorů lze nalézt v odkazu.¹³

Koktejly s inhibitory fosfatáz

Použití inhibitorů fosfatáz je zásadní pro všechny typy studií fosforylace. Nabízíme řadu koktejlů fosfatázových inhibitorů pokrývajících nejširší škálu fosfatáz, abychom zajistili ochranu proteinů před defosforylací. Řada obsahuje 2 koktejly: Koktejl fosfatázových inhibitorů 2 (Kat. No. P5726) a Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (Cat. No. P0044). Phosphatase Inhibitor Cocktail 3, náš nejnovější koktejl inhibitorů fosfatáz, je směs inhibitorů fosfatáz zaměřená na Ser/Thr fosfatázy. Koktejl inhibitorů fosfatáz 3 nahrazuje koktejl inhibitorů fosfatáz 1 (Kat. No. P2850). Rozdíl mezi oběma koktejly spočívá v tom, že nový koktejl Inhibitor fosfatázy 3 obsahuje kalikulin A místo mikrocystinu-LR v koktejlu Inhibitor fosfatázy 1. Tabulka 2 uvádí seznam inhibitorů v jednotlivých koktejlech.

Experimentální výsledky

Následující experimentální údaje porovnávají inhibiční účinek nového koktejlu inhibitoru fosfatázy 3 a koktejlu inhibitoru fosfatázy 1 (kat. č. P2850), který nahrazuje. Z údajů vyplývá, že aktivita obou koktejlů je rovnocenná.

Je důležité zmínit, že pro inhibici širokého spektra fosfatáz a účinné snížení celkové aktivity fosfatáz se doporučuje používat oba naše koktejly inhibitorů fosfatáz, koktejl inhibitorů fosfatáz 2 (Kat. No. P5726) a Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 (Cat. No. P0044).

Endogenní aktivita podobná PP1α v různých buněčných a tkáňových extraktech byla měřena pomocí radioaktivního substrátu 32P-Ser fosforylázy A při pH 7,5, 30 °C. Koktejl inhibitorů fosfatáz 1 (kat. č. P2850) nebo koktejl inhibitorů fosfatáz 3 (kat. č. P0044) byly přidány k extraktům v konečné koncentraci 1 % při 30 °C, 5 minut před testováním aktivity podobné PP1α. Aktivity uvedené na obrázku 1 jsou relativní, nikoli absolutní. Čím menší je zbývající aktivita, tím větší je stupeň inhibice koktejlem, který byl do reakce vložen.

* Hodnota zjištěná u těchto vzorků je příliš nízká na to, aby byla v grafu vidět, a je velmi blízká nule.

Obrázek 1. Inhibice aktivity podobné PP1α v buněčných a tkáňových extraktech

Inhibice aktivity podobné proteinové fosfatáze 1α

Koktejl inhibitorů fosfatáz 3 (Cat. No. P0044) je účinný inhibitor aktivity Protein phosphatase 1α-like v buňkách a tkáních. Následující experimenty prokazují jeho inhibiční účinnost a porovnávají ji s účinností dřívějšího koktejlu inhibitoru fosfatáz 1 (Kat. No. P2850).

Lidská placenta vykazuje 10-20krát vyšší PP1α-like aktivitu na mg proteinu než jiné tkáňové extrakty. Proto byla vybrána k prokázání účinnosti inhibice koktejlů inhibitorů fosfatáz.

Endogenní aktivita podobná PP1α v extraktu lidské placenty byla měřena pomocí radioaktivního substrátu P-Ser fosforylázy A při pH 7,5, 30 °C. Různá množství koktejlu inhibitorů fosfatáz 1 (Kat. No. P2850) nebo Fosfatase Inhibitor Cocktail 3 (Cat. No. P0044) byly přidány k extraktu při 30 °C, 5 minut před testováním aktivity podobné PP1α.

Endogenní aktivita podobná AP v extraktu z hovězích jater byla měřena v kolorimetrickém testu s použitím pNPP jako substrátu při pH 10,4, 37 °C. Inhibice byla provedena inkubací extraktu s koktejlem fosfatázového inhibitoru 3 (Cat. No. P0044) samostatně nebo společně s koktejlem fosfatázového inhibitoru 2 (Cat. No. P5726), po dobu 3 minut při 37 °C před testováním AP-like aktivity.

Inhibice aktivity alkalické fosfatáze (AP) podobné

Jak bylo uvedeno výše, různé izoenzymy alkalické fosfatázy jsou inhibovány různými inhibitory. Koktejl fosfatázových inhibitorů 3 (Kat. No. P0044) silně inhibuje L-izoformy alkalické fosfatázy přítomné v extraktech z hovězích jater a vykazuje synergický účinek při aplikaci s koktejlem inhibitorů fosfatázy 2 (Cat. No. P5726). (Obrázek 3A).

Koktejl inhibitoru fosfatázy 3 (Kat. No. P0044) má malý vliv na inhibici aktivity P-izoforem alkalické fosfatázy, které jsou v extraktech lidské placenty hojně zastoupeny, a proto se inhibice dosahuje použitím koktejlu inhibitoru fosfatázy 2 (Cat. No. P5726 (obrázek 3B).

Obrázek 3A a B. Dávkově závislá inhibice aktivity alkalické fosfatázy (AP) v extraktu z hovězích jater

1. Johnson L. 2009. The regulation of protein phosphorylation. 37(4):627-641. https://doi.org/10.1042/bst0370627

2. Moorhead G, De Wever V, Templeton G, Kerk D. 2009. Evolution of protein phosphatases in plants and animals. 417(2):401-409. https://doi.org/10.1042/bj20081986

3. I S, L S, E N. 2006. Protein kinases, their function and implication in cancer and other diseases. Folia Biol (Praha). 52(3):81-100.

4. Olsen JV, Blagoev B, Gnad F, Macek B, Kumar C, Mortensen P, Mann M. 2006. Global, In Vivo, and Site-Specific Phosphorylation Dynamics in Signaling Networks. Cell. 127(3):635-648. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.09.026

5. Graves JD, Krebs EG. 1999. Protein Phosphorylation and Signal Transduction. Pharmacology & Therapeutics. 82(2-3):111-121. https://doi.org/10.1016/s0163-7258(98)00056-4

6. Moss DW. 1992. Perspectives in Alkaline Phosphatase Research. 38(12):2486-2492. https://doi.org/10.1093/clinchem/38.12.2486

7. Onsgard-Meyer M, McCoy AL, Knox FG. 1996. Effect of Bromotetramisole on Renal Phosphate Excretion. Experimental Biology and Medicine. 213(2):193-195. https://doi.org/10.3181/00379727-213-44050

8. Crofton PM. 1982. Biochemistry of Alkaline Phosphatase Isoenzymes. CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 16(3):161-194. https://doi.org/10.3109/10408368209107027

9. Barford D. 1996. Molecular mechanisms of theprotein serine/threonine phosphatases. Trends in Biochemical Sciences. 21(11):407-412. https://doi.org/10.1016/s0968-0004(96)10060-8

10. Wera S, Hemmings BA. 1995. Serine/threonine protein phosphatases. 311(1):17-29. https://doi.org/10.1042/bj3110017

11. Swingle M, Ni L, Honkanen RE. Small-Molecule Inhibitors of Ser/Thr Protein Phosphatases: Specificity, Use and Common Forms of Abuse.23-38. https://doi.org/10.1385/1-59745-267-x:23

12. Wang W, Sun J, Zhang Z. 2003. An Overview of the Protein Tyrosine Phosphatase Superfamily. CTMC. 3(7):739-748. https://doi.org/10.2174/1568026033452302

13. Pestell KE, Ducruet AP, Wipf P, Lazo JS. 2000. Small molecule inhibitors of dual specificity protein phosphatases. Oncogene. 19(56):6607-6612. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1204084

14. Van Belle H, De Broe ME, Wieme RJ. 1977. L-p-Bromotetramisole, a new reagent for use in measuring placental or intestinal isoenzymes of alkaline phosphatase in human serum.. 23(3):454-459. https://doi.org/10.1093/clinchem/23.3.454

15. CHAKRABARTTY A, STINSON R. 1985. Properties of membrane-bound and solubilized forms of alkaline phosphatase from human liver. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 839(2):174-180. https://doi.org/10.1016/0304-4165(85)90034-0

16. Brunel C, Cathala G. 1972. Imidazole: An inhibitor of l-phenylalanine-insensitive alkaline phosphatases of tissues other than intestine and placenta. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 268(2):415-421. https://doi.org/10.1016/0005-2744(72)90337-3

17. Takai A, Mieskes G. 1991. Inhibitory effect of okadaic acid on the p-nitrophenyl phosphate phosphatase activity of protein phosphatases. 275(1):233-239. https://doi.org/10.1042/bj2750233

18. Lum H, Podolski JL, Gurnack ME, Schulz IT, Huang F, Holian O. 2001. Protein phosphatase 2B inhibitor potentiates endothelial PKC activity and barrier dysfunction. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 281(3):L546-L555. https://doi.org/10.1152/ajplung.2001.281.3.l546

19. B I P, R F, J W B, A P B, D L, G Z, I G F, J B N, D A H, B S L. 1994. Peroxovanadium compounds. A new class of potent. hosphotyrosine phosphatase inhibitors which are insulin mimetics J Biol Chem. 269(6):4596-604.

20. Cohen P, Alemany S, Therese BA, Resink J, Stralfors P, Lim Tung H. 1988. [37] Protein phosphatase-1 and protein phosphatase-2A from rabbit skeletal muscle.390-408. https://doi.org/10.1016/0076-6879(88)59039-0