Purifikace nebo odstranění albuminu a IgG

Albumin &; IgG Deplece sepharosy s vysokou účinností

Albumin a IgG jsou nejhojnější proteiny v plazmě, které mají tendenci zastírat signály méně hojných proteinů, což brání přesné detekci. Vysoký výskyt albuminu a IgG také narušuje detekci ostatních proteinů tím, že brání zahrnutí dostatečného množství méně hojných proteinů do analýzy. Odebráním albuminu a IgG ze vzorků lze výrazně zvýšit kvalitu a hloubku analýzy. Odstraněním těchto dvou látek se odstraní více než 60 % celkového obsahu bílkovin v lidské plazmě, což umožní vizualizaci bílkovin, které jsou normálně zastíněny albuminem a IgG.

Albumin &; IgG Depletion Sepharose High Performance je k dispozici předbalená ve formátech HiTrap^® a SpinTrap™ pro odstranění lidského sérového albuminu (HSA) a IgG. Oba typy kolon jsou předbaleny směsí antiHSA sepharose High Performance a Protein G sepharose High Performance. Ligand antiHSA Sepharose High Performance je založen na fragmentu jedné domény protilátky s vysokou specifitou a kapacitou pro HSA. Ligand Protein G Sepharose High Performance je odvozen z vazebných oblastí IgG proteinu G, povrchového proteinu bakterií Streptococcus. Ligand proteinu G váže lidské IgG1, IgG2, IgG3 a IgG4.

Primární použití produktů je příprava proteinových vzorků v malém měřítku před následnými analýzami, jako je 1-D nebo 2-D gelová elektroforéza a hmotnostní spektrometrie (MS).

Primární použití produktů je příprava proteinových vzorků v malém měřítku před následnými analýzami, jako je 1-D nebo 2-D gelová elektroforéza a hmotnostní spektrometrie (MS).

Při použití plazmy s obsahem albuminu a  IgG nad běžnou hladinou lidské plazmy (40 mg albuminu/ml a 15 mg IgG/ml) je třeba použít menší objem vzorku.

Charakteristiky chromatografického média

Tabulka 3.3 uvádí charakteristiky chromatografického média.

¹ Krátkodobé se vztahuje na interval pH pro regeneraci, čištění na místě a sanitační postupy. Dlouhodobým se rozumí interval pH, při kterém je médium dlouhodobě stabilní bez nepříznivých účinků na jeho následnou chromatografickou výkonnost.

Možnosti purifikace

Možnosti purifikace pro HiTrap^®. Albumin  IgG Depletion a Albumin  IgG Depletion kolony SpinTrap™ jsou uvedeny v
Tabulce 3.4.

¹Lidská plazma obsahující ~ 40 mg albuminu/ml a ~ 15 mg IgG/ml. Výsledky podle ELISA: > 95% deplece albuminu a > 90% deplece IgG.

Příklady purifikace

HiTrap^® Albumin &; IgG Deplece lze použít k depleci lidské plazmy bez ředění vzorku před zatížením. Na kolonu o objemu 1 ml byl nanesen objem 150 µl lidské plazmy a byla odebrána nenavázaná frakce obsahující depletovaný vzorek. Deplece albuminu a IgG je znázorněna analýzou SDS-PAGE (obrázek 3.4). Úroveň deplece byla rovněž stanovena pomocí testu ELISA a výsledek pro nenavázanou frakci byl 99 % deplece albuminu a 98 % deplece IgG.

Obrázek 3.4. Hluboce purpurově obarvená analýza SDS-PAGE (neredukující podmínky) frakcí z deplece lidské plazmy pomocí HiTrap® Albumin & IgG Depletion.

Provedení separace

Vazba vyrovnávací paměti:

Spojovací pufr: 20 mM fosforečnan sodný, 150 mM NaCl, pH 7,4.

Eluční pufr: Příprava vzorku: 100 mM glycin-HCl, pH 2,7

Příprava vzorku: Ředění lidské plazmy není nutné. Lidskou plazmu přefiltrujte přes 0,22 nebo 0,45 µm filtr těsně před nanesením na kolonu.

HiTrap^® Deplece albuminu a IgG

Pro celý postup deplece se doporučuje rychlost průtoku fl1 ml/min.

1. Naplňte hadičku pumpy vazebným pufrem. Odstraňte z kolony zátku a zacvakávací konec a připojte ji k hadičce pumpy "po kapkách", abyste zabránili vniknutí vzduchu do systému.
2. Propláchněte kolonu 5 ml vazebného pufru, abyste odstranili 20% zásobní roztok ethanolu.
3. Ekvilibrace 10 ml vazebného pufru.
4. Přiložte 150 µl filtrované lidské plazmy a promyjte nejméně 5 ml vazebného pufru, dokud absorbance nedosáhne ustálené základní hodnoty. Během nanášení a promývání vzorku sbírejte flutrální vzorek. V průtoku flowthrough se nachází vyčerpaný vzorek.
5. Volitelné: Eluce a sběr navázaných proteinů (albuminu a IgG) s 10 ml elučního pufru.

Poznámka: Krok 5 by se měl provést, pokud se má kolona znovu použít nebo pokud se má analyzovat navázaná  frakce albuminu a IgG.

Při manuálním postupu deplece (bez použití pumpy) se stříkačka připojí k  koloně pomocí dodaného konektoru Luer. Ujistěte se, že používáte flow rate přibližně 1 ml/min.

Upozorňujeme, že příliš vysoká flow rate poškodí obal chromatografického média a způsobí vysoký protitlak.

Albumin &; IgG Depletion SpinTrap™

1. Odstraňte skladovací roztok
   • A. Obraťte a opakovaně protřepejte kolonu SpinTrap™, aby došlo k resuspenzi média.
   • B. Odklopte spodní uzávěr kolony SpinTrap™ a uvolněte horní uzávěr o čtvrt otáčky.
   • C. Umístěte kolonu do 2 ml mikrocentrifugační zkumavky a odstřeďujte 30 s při 70 až 100 × g. Odstraňte zachycenou kapalinu.
   • Odstraňte a zlikvidujte horní uzávěr.
2. Rovnováha kolony
   • A. Přidejte 400 µl vazebného pufru a odstřeďujte 30 s při 800 × g. Odstraňte odebranou kapalinu.
   • B. Podruhé se přidá 400 µl vazebného pufru a odstřeďuje se 30 s při 800 × g. Získaná kapalina se zlikviduje.
3. Podání vzorku a inkubace
   • A. Umístěte kolonu do nové 2ml zkumavky.
   • B. Zřeďte 50 µl vzorku plazmy vazebným pufrem na konečný objem 100 µl a naneste na kolonu.
   • C. Inkubujte 5 min bez míchání.
4. Odběr vyčerpaného vzorku
   • A. Odstřeďujte 30 s při 800 × g. Sbírejte eluát.
   • B. Přidejte 100 µl vazebného pufru a odstřeďujte 30 s při 800 × g. Shromážděte eluát.
   • C. Podruhé přidejte 100 µl vazebného pufru a odstřeďujte 30 s při 800 × g. Shromážděte eluát.
5. Volitelně: eluce albuminu a IgG
   • A. Navázaný albumin a IgG lze eluovat 100 mM glycinem-HCl, pH 2,7.

Skladování

Skladujte při 4 °C až 8 °C ve 20% ethanolu.