Agarosové kuličky vs. magnetické kuličky v ChIP

Protilátka ChIP může být konjugována přímo na agarózové nebo magnetické kuličky nebo může být imobilizována na kuličky konjugované s proteinem A a/nebo proteinem G. Původní protokoly ChIP používaly agarózové kuličky, ale mnoho uživatelů, kteří ChIP dlouhodobě používají, přešlo na magnetické kuličky. Magnetické kuličky umožňují rychlou izolaci komplexů protein/DNA ze surové chromatinové směsi pomocí magnetického separačního zařízení, jako je například stojan Magna GrIP™ (20-400), stojan Magna GrIP™ HT96 (17-10071).

Agarosové kuličky se osvědčují v rukou mnoha výzkumníků a nabízejí levnější, ale časově náročnější variantu. Tyto kuličky vyžadují pro separaci centrifugaci a mohou vykazovat nespecifickou vazbu, což může vyžadovat blokování a předčištění lyzátu.

Nabízíme agarosové i magnetické kuličky a soupravy ChIP. Naše soupravy a kuličky nabízíme v různých formátech včetně proteinu A, proteinu G a také směsi konjugátů proteinu A a G (protein A/G). Výběr typu kuliček je často ovlivněn typem protilátky, kterou hodláte pro svůj experiment použít. Kuličky proteinu A vykazují nejvyšší afinitu ke králičím polyklonálním protilátkám, zatímco kuličky proteinu G vážou širší škálu protilátek včetně většiny, ale ne všech tříd myších monoklonálních IgG. Směs proteinů A/G poskytuje největší flexibilitu, pokud jde o typ protilátek, které můžete použít, protože kombinuje vazebné vlastnosti jak proteinu A, tak proteinu G. Náš výzkumný a vývojový tým zjistil, že směs proteinů A/G obvykle vytváří nižší pozadí než samotné proteiny A nebo G, a to pro širokou škálu protilátek, aniž by byla snížena účinnost pull down (obrázek 1).

 Protein A/G Beads: 17-646 ChIPAb+™ Hp1g (CBX3) Protein G Purified Mouse Monoclonal

.

Obrázek 1. Srovnání ChIP s použitím samotného proteinu A nebo G vs. směsi A/G. V souladu s nižším signálem pozadí jsou signály IgG detekovány později (vyšší Cq) při použití směsí kuliček proteinu A/G ve srovnání se samotnými kuličkami proteinu A nebo G (levý graf).

Při použití směsí proteinů A/G jsou navíc detekovány podobné hodnoty Cq ve srovnání se samotnými proteiny A nebo G, což naznačuje, že nedochází ke ztrátě signálu. Nižší pozadí s podobnou výtěžností signálu vede k vyššímu obohacení násobků pomocí směsí A/G, jak ukazuje graf vpravo.

 

Bez ohledu na výběr kuliček může pořadí, v jakém do reakce ChIP aplikujete magnetické nebo agarózové kuličky, ovlivnit signál ChIP. Jednou z metod je inkubace kuliček se záchytnou protilátkou (několik hodin při pokojové teplotě nebo přes noc při 4 °C), po níž následuje přidání chromatinu a další inkubace (1 hodina až noc s rotací, při 4 °C). Prodloužení doby inkubace může zvýšit jak pozadí, tak signál ChIP; protilátky s nízkou afinitou k cíli však obecně nevytvářejí významné signály ChIP bez delší inkubace (přes noc). Alternativně se v některých protokolech inkubuje protilátka a chromatin a poté se přidají kuličky nebo se přidají všechny tři složky najednou. Přidání všech tří složek často funguje a zkracuje dobu potřebnou k provedení celkové reakce.

Magnetické kuličky

Kousky proteinu A/G

Efektivní zachycení kuliček: Polyethylenový stojan obsahuje 4 neodymové magnety

Všestranné použití: Stojan lze použít i s 15 ml nebo 0.5 ml zkumavkami

Snadná manipulace: Ergonomicky navržený magnetický stojan má 8 otvorů vhodných pro 1,5-2,0 ml zkumavky nebo spinové kolony

.