Inhibice proteáz pomocí směsi inhibitorů proteáz

Směs inhibitorů proteáz od společnosti Cytiva obsahuje optimalizovanou koncentraci kompetitivních a nekompetitivních inhibitorů proteáz, které účinně inhibují serinové, cysteinové, metaloproteázové a kalpainové proteázy. Sada je vhodná k ochraně proteinů při purifikaci z živočišných tkání, rostlinných tkání, kvasinek a bakterií.

Protokol:

Dodávané reagencie

Mix inhibitoru proteázy (100× roztok), 1 ml.

Potřebné, ale nedodávané

Mikrocentrifuga, vírový mixér, extrakční roztok.

Předběžné poznámky

Směs inhibitorů proteáz se dodává bez EDTA, protože některé proteiny vyžadují pro svou biologickou aktivitu dvojmocné kationty, jako je Ca2+, Mg2+ nebo Mn2+. Za těchto okolností může být přítomnost EDTA škodlivá pro aktivitu proteinů ve vzorku.

Vzorky lze extrahovat do 8 M močoviny a 4 % CHAPS nebo do 7 M močoviny, 2 M thiomočoviny a 4 % CHAPS (viz roztoky A a B v příloze I). Během extrakce lze přidat alternativní neiontové detergenty nebo inhibitory proteáz. Nosné amfolyty (Pharmalytes, Ampholines nebo IPG pufry) lze přidat v koncentraci až 2 % pro standardní protokoly, ale neměly by se přidávat během extrakce proteinů pro značení v 2-D DIGE.

1. Počkejte, až se roztok zahřeje na pokojovou teplotu.
2. Před použitím roztok krátce promíchejte, protože je ve formě suspenze.
3. Směs inhibitoru proteázy zřeďte v poměru 1:100 (10 μl/ml) v příslušném objemu extrakčního pufru nebo extraktu.

Další možnosti

• Pokud je požadována vyšší účinnost inhibice proteáz, přidejte Protease Inhibitor Mix v koncentraci 20-30 μl/ml, abyste získali 2-3× konečnou koncentraci.
• Pro inhibici metaloproteáz přidejte EDTA přímo v příslušném objemu extrakčního pufru nebo extraktu, abyste v reakci získali konečnou koncentraci 5 mM EDTA.
  
  EDTA se nesmí přidávat, pokud se má roztok použít ve spojení s Nuclease Mix, protože EDTA působí jako inhibitor nukleáz.

A. Roztok pro přípravu vzorku (s močovinou) pro 2-D elektroforézu

[8 M močovina, 4 % CHAPS, 2 % Pharmalyte nebo IPG pufr (nosné amfolyty), 40 mM DTT, 25 ml]

* V případě potřeby lze koncentraci močoviny zvýšit na 9 nebo 9,8 M.
† Další neutrální nebo zwitteriontové detergenty lze použít v koncentraci až 2 % (m/V). Příklady zahrnují Triton X-100, NP-40, oktylglukosid a alkylamidosulfobetainové detergenty ASB-14 a ASB-16 (Calbiochem).
‡ Nosné amfolyty (Pharmalyte nebo IPG pufr) a DTT by měly být z extrakčního roztoku vyloučeny, pokud mají být vzorky označeny pomocí 2-D DIGE. Podrobnosti naleznete v uživatelské příručce Ettan DIGE.
§ Použijte IPG pufr v rozsahu pH odpovídajícím rozsahu pH separace IEF, která má být provedena, nebo Pharmalyte v rozsahu pH blížícím se rozsahu pH separace IEF, která má být provedena.

Skladujte v alikvotech o objemu 2,5 ml při teplotě -20 °C.

Poznámka: V případě potřeby lze přidat inhibitory proteáz.

B. Roztok pro přípravu vzorků (s močovinou a thiomočovinou) pro 2-D elektroforézu

[7 M močovina, 2 M thiomočovina, 4 % CHAPS, 2 % Pharmalyte nebo IPG pufr (nosné amfolyty), 40 mM DTT, 25 ml]

* Jiné neutrální nebo zwitteriontové detergenty lze použít v koncentraci do 2 % (w/v). Příklady zahrnují Triton X-100, NP-40, oktylglukosid a alkylamidosulfobetainové detergenty ASB-14 a ASB-16 (Calbiochem).
† Nosné amfolyty (Pharmalyte nebo IPG pufr) by měly být z extrakčního roztoku vyloučeny, pokud mají být vzorky označeny pomocí 2-D DIGE.
‡ Použijte IPG pufr v rozsahu pH odpovídajícím rozsahu pH separace IEF, která má být provedena, nebo Pharmalyte v rozsahu pH blížícím se rozsahu pH separace IEF, která má být provedena.

Skladujte v 2,5ml alikvotech při -20 °C