Extrakce jaderných proteinů bez detergentů

Detergenty mohou narušit účinnost značení extrahovaných proteinů. Proto by měl být pro přípravu jaderných proteinů použit postup, který nezahrnuje použití detergentů.

Pro přípravu jaderných proteinů lze použít soupravu CellLytic™ NuCLEAR™ Extraction Kit (produkt č.  NXTRACT). Určitě použijte postup, který vynechává použití detergentu. Extrakt jaderného proteinu připravený pomocí této soupravy vyžaduje dialýzu k úpravě pH před značením barvivy Cy.

Následující postup je určen pro extrakci proteinu z 200 µl objemu sbalených buněk (PCV) a představuje postup bez použití detergentu v soupravě. Pro jiné objemy sbalených buněk proveďte odpovídající výpočet.

Poznámka: Následující postup popisuje přípravu surových jaderných extraktů pomocí stříkačky nebo skleněného tkáňového homogenizátoru. Postup vyžaduje nejméně 100 µl PCV. Pro přípravu v malém měřítku (0,1-1 ml) se doporučuje použít injekční stříkačku. Průchod více než 1 ml stříkačkou může způsobit potíže vzhledem k velikosti měrky jehly.

Extrakce z buněk

1. Připravte si čerstvý roztok 0,1M DTT s ultračistou sterilní vodou.
2. Připravte lyzační pufr:
       - hypotonický: 10 mM HEPES, pH 7,9, s 1.5 mM MgCl₂ a 10 mM KCl.
       - izotonický (nebo extrakce proteinů z křehkých buněk): 10 mM Tris HCl, pH 7.5, with 2 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 0.3 M Sucrose.
3. To 1,400 µL of Lysis Buffer (hypotonic or isotonic), add 14 µL of the 0.1 M roztoku DTT a 14 µl koktejlu inhibitorů proteáz.
4. Připravte extrakční pufr: 20 mM HEPES, pH 7,9, s 1,5 mM MgCl₂, 0,42 M NaCl, 0,2 mM EDTA, 25 % (v/v) glycerolu.

Z adherentních buněk

1. Pěstujte buňky na konfluenci 70-80 %.
2. Odstraňte z buněk růstové médium.
3. Dvakrát propláchněte buňky PBS, přičemž dávejte pozor, abyste žádné buňky nevytlačili.
4. Odstraňte PBS. Seškrábněte buňky pomocí čerstvého PBS a shromážděte je do vhodné kónické centrifugační zkumavky.
5. Centrifugujte 5 minut při 450 x g.
6. Dekantujte a zlikvidujte supernatant.
7. Odhadněte objem sbalených buněk (PCV).
8. Pokračujte krokem 7 postupu pro neadherentní buňky.

Z neadherentních buněk

1. Sbírejte buňky do vhodné centrifugační kónické zkumavky.
2. Centrifugujte 5 minut při 450 x g.
3. Dekantujte a zlikvidujte supernatant.
4. Buňky dvakrát promyjte resuspendováním buněčných pelet v PBS a odstřeďujte 5 minut při 450 x g.
5. Dekantujte a zlikvidujte supernatant.
6. Odhadněte objem sbalených buněk (PCV).
7. Přidejte 1 ml (5X PCV) lyzačního pufru (včetně DTT a inhibitorů proteáz) do 200 µl PCV.
8. Pelet buněk jemně resuspendujte. Zabraňte tvorbě pěny. Pokud pracujete s malými objemy, můžete suspendované buňky přenést do mikrocentrifugační zkumavky.
9. Inkubujte zabalené buňky v lyzačním pufru po dobu 15 minut, aby buňky nabobtnaly.
10. Centrifugujte suspendované buňky po dobu 5 minut při 420 x g. Dekantujte supernatant a resuspendujte peletu balených buněk ve 400 µl (2X PCV) lyzačního pufru.
11. Pomocí skleněného tkáňového homogenizátoru přeneste buňky do skleněné zkumavky na mletí tkání. Pomalu rozmělněte na ledu pěti tahy nahoru a dolů pomocí pěchovadla typu B. Vyhněte se tvorbě pěny.
    OR
    Pomocí injekční stříkačky s úzkou podkožní jehlou (č. 27) naplňte stříkačku lyzačním pufrem. Píst stříkačky se používá k co největšímu vytlačení pufru. Tím se z injekční stříkačky odstraní veškerý vzduch a zabrání se vhánění přebytečného vzduchu do buněčné suspenze během lýzy. Buněčnou suspenzi pomalu natáhněte do stříkačky a poté ji jedním rychlým tahem vypusťte. Opakujte pětkrát.
    Poznámka:
        - Počet potřebných zdvihů (při použití tkáňového homogenizátoru nebo stříkačky) se u různých buněčných linií liší. Začněte s 5 tahy
          a poté zkontrolujte lýzu pod mikroskopem. Lýza by měla být 80-90 %. Pokud není lýza dostatečná, proveďte několik dalších
         tahů, dokud nebude lýza úplná.
         - Lýzu lze pozorovat přidáním roztoku Trypanovy modři do alikvotu buněk. Barvivo je vyloučeno z neporušených
        buněk, ale barví jádra lyzovaných buněk. Pokud se zviditelní jaderná lýza nebo shluky jader, nebo pokud je
           pozorována gelovitá hmota, mohlo být narušení buněk příliš razantní nebo bylo provedeno příliš mnoho tahů.
12. Centrifugujte rozrušené buňky v suspenzi po dobu 20 minut při 10 000-11 000 x g.
13. Přeneste supernatant do čerstvé zkumavky. Tato frakce je cytoplazmatická frakce.
14. Přidejte 1,5 µl 0,1 M roztoku DTT a 1,5 µl koktejlu inhibitoru proteáz do 147 µl extrakčního pufru.
15. Resuspendujte pelet surových jader v ~140 µl (2/3X PCV) extrakčního pufru obsahujícího DTT a inhibitory proteáz. Pokud se postup provádí pomocí tkáňového homogenizátoru, doporučuje se v tomto bodě provést ještě 10 tahů.
16. Petřete jemně po dobu 30 minut.
17. Centrifugujte 5 minut při 20 000-21 000 x g.
18. Převeďte supernatant do čisté, chlazené zkumavky.
19. Pokračujte v dialýze nebo uchovávejte při -70 °C.

Extrakce z tkáně

Následující postup je určen pro extrakci jaderných proteinů ze 100 mg tkáně. Pro jinou hmotnost tkáně proveďte odpovídající výpočet.

1. Připravte čerstvý roztok 0,1M DTT s ultračistou sterilní vodou.
2. Připravte lyzační pufr
       a. Připravte čerstvý roztok 0,1M DTT s ultračistou sterilní vodou.
       b. Připravte lyzační pufr:
           - hypotonický: 10 mM HEPES, pH 7,9, s 1.5 mM MgCl₂ a 10 mM KCl.
           - izotonická (nebo extrakce bílkovin z křehkých buněk): 10 mM Tris HCl, pH 7,5, s 2 mM MgCl₂, 3 mM CaCl₂, 0,3 M sacharózy. 
       c. K 1 400 µl lyzačního pufru (hypotonického nebo izotonického) přidejte 14 µl 0,1 M roztoku DTT a 14 µl koktejlu proteázových
            inhibitorů.
   Poznámka: U námi testovaných tkání fungoval hypotonický pufr lépe než izotonický. Pokud se ukáže, že tkáň je příliš křehká, lze použít izotonický lyzační pufr.
3. Příprava extrakčního pufru
       a. Připravte si extrakční pufr: 20 mM HEPES, pH 7,9 s 1,5 mM MgCl₂, 0,42 M NaCl, 0,2 mM EDTA, 25 % (v/v) glycerolu.
       b>. Přidejte 1,5 µl připraveného 0,1 M roztoku DTT a 1,5 µl koktejlu inhibitorů proteáz do 147 µl extrakčního pufru.
4. Tkáň dvakrát opláchněte pufrem PBS. PBS zlikvidujte.
5. Tkáň jemně resuspendujte v 1 ml (5X PCV) lyzačního pufru obsahujícího DTT a inhibitory proteáz.
6. Tkáň homogenizujte (pomocí tkáňového homogenizátoru), dokud se nerozbije více než 90 % buněk a jádra nejsou viditelná pod mikroskopem.
7. Narušené buňky centrifugujte 20 minut při 10 000-11 000 x g.
8. Přeneste supernatant do čerstvé zkumavky. Tato frakce je cytoplazmatická frakce.
9. Resuspendujte pelet surových jader v ~140 µl (2/3X PCV) extrakčního pufru obsahujícího DTT a inhibitor proteáz. V této fázi lze provést krátkou homogenizaci, aby se usnadnila extrakce jader.
10. Jemně třepejte po dobu 30 minut.
11. Centrifugujte 5 minut při 20 000 - 21 000 x g.
12. Převeďte supernatant do čisté, chlazené zkumavky.
13. Dále pokračujte dialýzou nebo uchovávejte při -70 °C.

Dialýza

Před provedením postupu značení je důležité uvést extrakt dialýzou na požadované pH.

1. Připravte si 0,1M, pH 9,5-9,6, uhličitano-bikarbonátový pufr (rozpusťte 2 kapsle výrobku č.  C3041 ve 100 ml vody).
2. Dialyzujte při 4 °C po dobu 2 hodin v dialyzačním pufru o objemu 1000násobku objemu extraktu jaderného proteinu. 
3. Dialyzační pufr vyměňte za čerstvě připravený uhličitanový pufr a dialyzujte další 2 hodiny při 4 °C. Stanoví se koncentrace bílkovin podle Bradfordova postupu.