Metody růstu kvasinek

Yeasts jsou považovány za modelové systémy pro studium eukaryot, protože vykazují rychlý růst a mají rozptýlené buňky. Kromě toho se replikace a izolace mutantních buněk kvasinek provádí relativně snadno, protože mají dobře definovaný genetický systém. Nejvýznamnější je, že kvasinky mají velmi univerzální systém transformace DNA, který lze efektivně využít pro produkci proteinů.

Kvasinky se běžně pěstují v médiu YPD. Písmeno "Y" ve slově YPD označuje kvasničný extrakt, který obsahuje ve vodě rozpustné sloučeniny vznikající při nuceném samostravování kvasinek. "P" označuje pepton, směs peptidů a aminokyselin připravenou trávením živočišných bílkovin pomocí proteáz. "D" označuje dextrózu neboli glukózu, zdroj uhlíku pro kvasinky. YPD obsahuje základní živiny, které uspokojují metabolické požadavky buněk. Určitá média však vyžadují definované složení, pro potřeby aplikace byla vyvinuta řada syntetických médií. Jednotlivé složky syntetických médií lze upravit tak, aby vyhovovaly potřebám experimentu.

Přehled sekcí

• Protokoly růstu kvasinek v různých médiích
• Konzervace a oživení kmene kvasinek
• Kultury kvasinek
ul>
• Média pro kultury kvasinek
• Doplňky pro syntetické kapénkové médium
• Další doplňky pro kvasinkové kultury

Protokoly pro pěstování kvasinek v různých médiích

Níže uvedené protokoly lze použít pro pěstování a udržování kvasinek v tekutých a pevných médiích:

Růst kvasinek v bujónu YPD

1. Vysušte 50 g bujónu YPD (produkt č. 1) a vmíchejte do něj 50 g bujónu YPD (produkt č. 2). Y1375h) v 1 l destilované vody
2. Autoklávujte 15 minut při 121 °C
3. Inokulujte kultury kvasinek (pocházející z kvasničných bujónů/plátů) do zkumavek/lahví bez detergentů obsahujících připravené tekuté médium. Médium by nemělo být větší než třetina objemu zkumavky s kulturou nebo pětina celkového objemu baňky
4. Krátce obsah promíchejte, aby se buňky rozptýlily
5. Kultivaci provádějte v třepacím inkubátoru při 300 otáčkách za minutu (u baněk) nebo 350 otáčkách za minutu (u kultivačních zkumavek)

Růst kvasinek na YPD agaru

1. Suspendujte 65 g YPD agaru (výrobek č. 1) a přidejte k němu 65 g YPD agaru. Y1500) v 1 l destilované vody
2. Zahřívejte za stálého míchání k varu, aby se všechny složky zcela rozpustily
3. Autoklávujte 15 minut při 121 °C
4. Nalijte asi 25-30 ml agarového média na sterilní destičky a nechte jej ustálit v laminární komoře
5. Nasaďte (kvasinky získané z YPD destičky)/rozprostřete (kvasinky získané z bujónových kultur) buňky na agarové destičky a inkubujte při 30 °C

Poznámka: Jednotlivé kolonie kvasinek lze pozorovat přibližně po 24 hodinách, ale před jejich použitím pro účely replikace je nutná inkubace delší než 48 hodin. Rychlost růstu kultur kvasinek s použitím syntetických doplňků vysazovacího média je ~50 % pomalejší.

KONZERVOVÁNÍ A OŽIVOVÁNÍ Kvasinkových kmenů

Kvasinkové buňky vypěstované výše uvedenými metodami lze skladovat zmrazené v glycerolu při -70 °C po dobu více než 3 let nebo v bohatých kusech média při 4 °C po dobu 6 měsíců až jednoho roku. YPD destičky s kvasinkovými buňkami lze rovněž skladovat při 4 °C po dobu 2 až 3 měsíců uzavřené fólií Parafilm®. Protokoly pro konzervaci a oživení kvasinkových buněk jsou uvedeny níže:

Kvasinkové buňky Konzervace

1. Připravte si sterilní 30% (w/v) roztok glycerolu (výrobek č. 1), který se uchovává v roztoku. G5516)
2. Přidejte 1,0 ml roztoku glycerolu do 4 ml sterilních lahviček se šroubovacím uzávěrem
3. Přidejte 1.0 ml bujónu kvasinek v rané stacionární/pozdní log fázi seškrábněte velké inokulum z čerstvě vypěstované plotny
4. Resuspendujte v 1 ml sterilního 30% roztoku glycerolu
5. Smíchejte, zmrazte na suchém ledu a uchovávejte při -70 °C

Poznámka: Kvasinkové buňky lze podobně skladovat také s použitím 8% (v/v) dimethylsulfoxidu (DMSO, produkt č. 1). D8418).

Oživení kvasinkového kmene

1. Zmrazený zásobní materiál seškrábněte sterilním párátkem nebo bakteriologickou jehlou
2. Kvasinkové buňky rozložte na příslušnou destičku a inkubujte při 30 °C

Poznámka: Vyhněte se rozmrazování zásoby. V případě, že se zásoba rozmrazila, před opětovným zmrazením ji dobře vortexujte.

KULTURY KVASINEK

Kvasinky se obvykle pěstují v YPD nebo syntetickém médiu při 30 °C. Nabízíme širokou škálu růstových médií a doplňků pro vaše specifické použití v práškové i tekuté formě.

Související produkty

Média pro kultivaci kvasinek

Syntetické doplňkové látky pro médium Drop-Out (používá se spolu s Yeast Nitrogen Base bez aminokyselin, č. výrobku Y0626)

Další doplňky pro kultury kvasinek

Odkazy

1. Sherman F. 2002. Getting started with yeast.3-41. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(02)50954-x

2. MacDonald PN. 2001. Two-Hybrid Systems. https://doi.org/10.1385/1592592104

3. Treco DA, Winston F. 2008. Growth and Manipulation of Yeast. Current Protocols in Molecular Biology. 82(1): https://doi.org/10.1002/0471142727.mb1302s82

4. Schiestl RH, Gietz RD. 1989. High efficiency transformation of intact yeast cells using single stranded nucleic acids as a carrier. Curr Genet. 16(5-6):339-346. https://doi.org/10.1007/bf00340712

5. Li B, Fields S. 1993. Identification of mutations in p53 that affect its binding to SV40 large T antigen by using the yeast two?hybrid system. FASEB j.. 7(10):957-963. https://doi.org/10.1096/fasebj.7.10.8344494