Protokoly pro růst mikroorganismů

Kultivace E. coli

LB bujón (Miller) je granulované médium pro kultivaci E. coli v rozsahu od malých kultur až po fermentaci. Granule zajišťují rychlé a rovnoměrné rozpuštění ve vodě a zabraňují shlukování média a vdechování prášku ve vzduchu. 

Potřebné materiály:

Založení startovací kultury

1. Odberte jednu kolonii z čerstvě rozetřené plotny a naočkujte startovací kulturu 3 až 5 ml média.
   
2. Použijte vhodné antibiotikum a inkubujte při teplotě 37 °C* přibližně 8 hodin při třepání při 250-300 otáčkách za minutu.
   
3. Použijte startovací kulturu k inokulaci noční kultury. Zřeďte startovací kulturu v poměru 1:500 až 1:1000 ve velké baňce s příslušným objemem média a inkubujte při 37 °C* po dobu 12 až 16 hodin při třepání při 250-300 otáčkách za minutu.

*Tato teplota je určena pro standardní E. coli. Některé bakterie vyžadují jiné kultivační teploty.

Suspenze kultury E. coli

1. Prepare LB medium by weighing appropriate powder medium and adding to water in a sterile flask
2. Autoclave the broth and cool to room temperature
   (Alternativně lze použít LB médium připravené k použití)
   
3. V laminární průtokové komoře přeneste přibližně 1 ml nočního E. coli kultury do baňky
4. Uzavřete ústí baňky sterilní bavlněnou (nenasákavou) zátkou; zajistěte, aby baňka nebyla těsně uzavřena
5. Inkubujte přes noc při 37 °C za stálého protřepávání

.

Plating E. coli

1. Připravte LB agar navážením příslušného práškového média, agaru a vody do sterilní baňky
2. Autoklávujte médium a ochlaďte ho jen natolik, abyste mohli s baňkou manipulovat
3. V laminární komoře nalijte přibližně 25-30 ml LB agaru do sterilních destiček
4. Připravte LB agar na sterilní destičky
5. Desky nechte v laminární komoře s mírně pootevřenými víčky ustálit
   (Desky lze také skladovat obrácené při teplotě 4 °C pro budoucí použití)
   (Alternativně lze použít desky s LB agarem připravené k použití)
   • Lehce poškrábejte povrch zmrazeného E. coli glycerolové zásoby sterilní inokulační smyčkou
   • Sterilní inokulační smyčkou seberte kolonii E. coli z destičky s kulturou
   • Přidejte 10-100 µl E. coli. coli suspenzní kultury a přidejte ji na destičku s LB agarem
     • Přetáhněte kličku přes destičku s LB agarem
     • Rozetřete kulturu po celé destičce pomocí sterilního skleněného roztírače
6. Invertujte a inkubujte destičky přes noc při 37 °C

Pokročilé protokoly

Plating bakteriofága M13

Potřebný materiál:

1. Připravte čistou kulturu E. coli naočkováním jedné kolonie do 5 ml LB nebo YT média.
2. Připravte desetinásobné sériové ředění zásobního bakteriofágu M13 v LB nebo YT médiu.
3. Připravte LB agar nebo YT médium doplněné 5mM MgCl₂ve sterilních zkumavkách; vyrovnejte při 47 °C; přidejte odpovídající množství roztoků X-gal a IPTG.
4. Přidejte sériově zředěné zásoby bakteriofágů M13 100 µl čisté bakteriální kultury; promíchejte jemným vířením.
5. Přelijte LB agar nebo YT médium s X-gal a IPTG do zkumavek obsahujících infikované bakterie; promíchejte jemným vířením.
6. Přeneste obsah na desku a vířte, aby došlo k rovnoměrnému rozložení infikovaných bakterií.
7. Počkejte, až se destičky ustálí; invertujte a inkubujte destičky při 37 °C.
8. Na trávníku s bakteriálním růstem se objeví bleděmodré destičky bakteriofága M13.

Následující komponenty bakteriálního bujónu nabízí naše společnost:

Odkazy

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

2. Parija S. 2009. Textbook of Microbiology and Immunology. Elsevier India.

3. Types of Growth Media Used to Culture Bacteria. [Internet].[updated 02 Aug 2016; cited 05 Aug 2020]. Available from: http://www.scienceprofonline.org/microbiology/types-culture-media-for-growing-bacteria.html