Použití derivatizačních činidel pro plynovou chromatografii (GC)

Jay Jones, Katherine Stenerson

Reporter US Edition 25.1

Úvod

V porovnání s jinými technikami, jako je například HPLC, je rozsah analytů při GC analýze poněkud omezený. Několik příčin lze přičíst sloučeninám s nízkou nebo žádnou těkavostí nebo sloučeninám se špatnou tepelnou stabilitou. Přístupem k překonání těchto problémů je modifikace analytu do formy, která je pro GC lépe využitelná, pomocí procesu derivatizace.

BSTFA + TMCS jako derivatizační činidlo pro GC

Derivatizace je technika, která obvykle zahrnuje reakci analytu(ů), který(é) nás zajímá(jí), s určitým derivatizačním činidlem. Existuje množství činidel, která lze použít v závislosti na charakteru a funkčnosti analytů. Jedno z nejčastěji používaných v GC analýzách zahrnuje reakci, která přidává trimethylsilyl (TMS) funkční skupinu ke sloučenině. Tento postup je také znám jako trimethylsilylace. Pro tuto reakci se pravidelně používá činidlo N,Obis( trimethylsilyl)trifluoroacetamid (nazývaný také BSTFA).

Snadnost derivatizace různých funkčních skupin pro dané silylační činidlo probíhá v tomto pořadí: alkohol > fenol > karboxylová kyselina > amin > amid. V tomto pořadí bude reaktivita vůči konkrétnímu silylačnímu činidlu ovlivněna také sterickými překážkami. Proto se snadnost reaktivity u alkoholů řídí pořadím: primární > sekundární > terciární a u aminů: primární > sekundární.

Pro středně obtížně nebo pomalu reagující sloučeniny lze k BSTFA přidat katalyzátor. Mezi nejběžnější katalyzátory patří trimethylchlorosilan (nazývaný také TMCS), kyselina trifluoroctová, chlorovodík, octan draselný, piperidin, O-methylhydroxylamin hydrochlorid a pyridin.

Úvahy o postupu derivatizace

Při provádění derivatizační reakce je třeba zvážit několik parametrů. Například alkohol se může plně derivatizovat během několika minut při pokojové teplotě. Dokončení reakce amidu nebo karboxylové kyseliny se sterickými překážkami však může trvat hodiny při zvýšené teplotě.

Společně s časem a teplotou je důležitá koncentrace činidla. Doporučuje se přidávat silylační činidlo v nadbytku. Obecně platí, že přidávejte nejméně 2:1 molární poměr BSTFA k aktivním vodíkům.

Většina derivatizačních reakcí je citlivá na vodu. Přítomnost vody může reakci zpomalit nebo zcela zastavit. Vlhkost může také rozkládat TMS činidlo nebo vznikající deriváty. Proto se doporučuje derivatizační činidla skladovat v sekundárním kontejneru, který obsahuje vysoušedlo. Kromě toho by měla být z extraktu, který má být derivatizován, odstraněna vlhkost.

Příklady derivatizace

Bez derivatizace vykazují estrogenní sloučeniny a amid kyseliny lysergové (LSD) malou nebo žádnou odezvu při GC analýze. Po přidání skupiny TMS vykazují tyto analyty skvělý tvar píku a odezvu. V následujících odstavcích jsou podrobně popsány kroky, které byly provedeny k zajištění dokončení derivatizačních reakcí manipulací s výše uvedenými úvahami o postupu.

Ze čtyř estrogenních sloučenin byly tři plně derivatizovány během 30 minut při 75 °C. U estriolu se však zdálo, že během 30 minut došlo k silylaci pouze dvou jeho aktivních hydrogenů (podle spektrálních údajů získaných z analýzy GC-MS). Extrakt byl derivatizován podruhé při 75 °C. Navíc byla reakční doba prodloužena na 45 minut. Poté, co se nechal přes noc působit při pokojové teplotě, analýza GC-MS potvrdila, že všechny tři aktivní hydrogeny byly nahrazeny skupinami TMS. Obrázek 1 ukazuje konečný chromatogram.

Obrázek 1. GC analýza estrogenních sloučenin

Amid kyseliny lysergové (LSD) byl derivatizován za podobných podmínek jako estrogenní sloučeniny, ale při 68 °C. Vzorky z této reakce byly odebírány v intervalu 30 minut. Při této teplotě tato reakce nikdy nepřekročila 60 % dokončení, a to ani po 5 hodinách. Poté byla teplota zvýšena na 75 °C. Zvýšená teplota posunula reakci na přibližně 95 % dokončení. I po téměř třech hodinách byl při GC analýze stále detekován pík LSD i LSD (TMS), což znamená, že reakce nebyla dokončena na 100 %. Tento chromatogram je zobrazen na obrázku 2.

Obrázek 2. GC analýza LSD-TMS

Závěr

Derivatizační reakce umožňují rozšířit škálu analytů, které lze analyzovat pomocí GC. Existuje však několik parametrů, které mohou vyžadovat určité pokusy a omyly pro optimalizaci reakce. V uvedených příkladech byla pro dokončení reakcí rozhodující teplota i čas. Tyto dva příklady ilustrují, že každá derivatizační reakce musí být optimalizována, aby bylo dosaženo vysokého procenta dokončení derivatizace, což vede k dobrému tvaru píku a odezvě detektoru.

Odkazy

1. Knapp DR. 1979. Handbook of Analytical Derivatization Reactions, John Wiley & Sons, New York..