Derivatizace a analýza aminokyselin pomocí GC-MS

Katherine K. Stenerson

Reporter US Volume 25.3

Úvod

Typicky se k analýze aminokyselin používá vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC). Lze však použít i GC a v některých případech může být díky dostupnosti přístrojového vybavení nebo provozním nákladům lepší volbou. Polární povaha aminokyselin vyžaduje před GC analýzou derivatizaci. Cílem derivatizace je učinit analyt těkavějším, méně reaktivním, a tím zlepšit jeho chromatografické chování. V případě aminokyselin derivatizace nahrazuje aktivní hydrogeny na OH, NH2 a SH polárních funkčních skupinách nepolární částí

.

Přehled sekcí

• Experimentální
• .Výsledky
• Závěr
• Reference

Silylace je velmi běžná derivatizační technika, která je užitečná pro širokou škálu sloučenin. Hlavní nevýhodou této metody je její citlivost na vlhkost. Přítomnost vlhkosti má za následek nízký výtěžek reakce a nestabilitu derivatizovaných analytů. V této studii jsme hodnotili použití silylačního činidla N-terc-butyldimethylsilyl- N-methyltrifluoroacetamidu (MTBSTFA) pro derivatizaci aminokyselin. MTBSTFA vytváří terc-butyl-dimethylsilylové (TBDMS) deriváty při reakci s polárními funkčními skupinami obsahujícími aktivní vodík:

Obrázek 1. Struktura MTBSTFA

Deriváty MTBSTFA jsou stabilnější a méně citlivé na vlhkost než deriváty vytvořené pomocí činidel s nižší molekulovou hmotností, jako je N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamid (BSTFA) (1).

Experimentální

V roztoku obsahujícím směs L-aminokyselin o koncentraci 91 μg/ml v 0.1 N HCl byl vysušen a bylo přidáno 100 μl čistého MTBSTFA a následně 100 μl acetonitrilu. Směs byla zahřívána při 100 °C po dobu 4 hodin. Vzorek byl poté neutralizován hydrogenuhličitanem sodným a podroben GC-MS analýze na kapilární koloně SLB™-5ms o rozměrech 20 m x 0,18 mm I.D. x 0,18 μm.

Výsledky

Chromatogram TBDMS derivátů aminokyselin je uveden na obrázku 2. Spektrální údaje získané z píků pomohly při identifikaci derivátů aminokyselin. Nahrazení aktivního vodíku skupinou TBDMS přidává 114 k molekulové hmotnosti. Elektronová impaktní spektra (2) těchto derivátů obsahují typické fragmenty odpovídající molekulové hmotnosti derivátu snížené o CH₃. (M-15), C₄H₉ (M-57), C₄H₉ + CO (M-85) a CO-O-TBDMS (M-159). Obrázek 3 ukazuje příklad tohoto fragmentačního vzorce ve spektru TBDMS-valinu.

Obrázek 2. GC-MS analýza derivátů aminokyselin na SLB-5ms (28564-U)

Obrázek 3. Hmotnostní spektrum TBDMS derivátu valinu (MW derivátu = 345)

Při použitých reakčních podmínkách vznikl u většiny aminokyselin jeden derivát, přičemž aktivní vodíky na hydroxylových, aminových a thiolových skupinách (v případě cysteinu) byly nahrazeny TBDMS. Některé aminokyseliny vytvářely více derivátů, konkrétně asparagin, glutamin a tryptofan. V případě těchto aminokyselin lze zabránit úpravě reakčních podmínek, například snížením teploty nebo změnou reakční doby (3). Například prodloužení reakční doby ze 2 na 4 hodiny vedlo ke zvýšení odezvy plně derivatizované formy tryptofanu.

Přestože jsou deriváty TBDMS stabilnější než tradiční deriváty TMS, jejich vyšší molekulové hmotnosti mají za následek delší eluční časy při GC analýze. Aby se to vyvážilo, byla separace provedena na krátké kapilární koloně s úzkým otvorem. Pro zachování rozlišení píku derivátu glycinu od rozpouštědla byla nutná počáteční teplota nejvýše 100 °C. Po eluci derivátu cystinu byl proveden rychlý náběh na 360 °C, aby byla zajištěna čistota kolony pro následné analýzy.

Závěr

Tato studie ukazuje, že při správném použití derivatizačních činidel, jako je MTBSTFA, lze aminokyseliny analyzovat pomocí GC-MS. Reakční podmínky může být nutné "vyladit", aby se dosáhlo maximální odezvy derivátů, které jsou předmětem zájmu. Deriváty vytvářejí charakteristické fragmenty, které umožňují snadnou identifikaci pomocí MS. Pro zkrácení celkové doby GC analýzy těchto derivátů se doporučuje krátká úzkoprsá kolona, například SLB-5ms 20 m x 0,18 mm I.D. x 0,18 μm.

Odkazy

1. Sobolevsky TG, Revelsky AI, Miller B, Oriedo V, Chernetsova ES, Revelsky IA. 2003. Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids. J. Sep. Science. 26(17):1474-1478. https://doi.org/10.1002/jssc.200301492

2. Kitson FG, Larsen BS, McEwen CN. Gas Chromatography and Mass Spectrometry, A Practical Guide; Academic Press: San Diego, 1996; Chapter 9..

3. Molnár-Perl I, Katona ZF. 2000. GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/t-butyldimethylsilyl Derivatives: In model solutions III. Chromatographia. 51(1):S228-S236. https://doi.org/10.1007/bf02492811