Detekce jednotlivých molekul pomocí Atto 647N NTA

Ruud Hovius, Emmanuel Guignet, Jean-Manuel Segura, Joachim Piguet, Horst Vogel

Významné zlepšení sledování jednotlivých molekul pomocí vynikajícího fluorescenčního konjugátu NTA-Atto 647N

Ruud Hovius, Emmanuel Guignet, Jean-Manuel Segura, Joachim Piguet & Horst Vogel (Institute de Science Biomoleculaire, EPFL, Švýcarsko), Monika Bäumle (Merck)

• Atto 647N je vynikající fluorescenční barvivo pro experimenty se sledováním jednotlivých molekul
• Vynikající fotostabilita značky umožňuje získat výrazně vyšší obsah informace

Všeobecné výhody fluorescenčních konjugátů NTA

Fluorescenční konjugáty NTA byly použity k detekci proteinů značených oligohistidinem na blotech, v gelech nebo v roztoku (obrázek 1). Nedávno byl tento přístup rozšířen na detekci a charakterizaci proteinů v živých buňkách (Guignet 2004).

Obrázek 1. Interakce Ni-NTA-chromoforu s proteinem značeným oligohistidinem.

Hlavní výhody této metody značení jsou:

• flexibilita použití fluoroforu, který je pro danou aplikaci nejvhodnější - povaha fluoroforu má malý vliv na vazebné vlastnosti NTA-sondy k His-tagu. Disociační konstanty pozorované pro vazbu na zelený fluorescenční protein značený hexa a dekahistidinem v roztoku se pohybují v rozmezí 5 až 0,5 μM.
• velmi rychlá kinetika - bylo prokázáno, že značení v buňkách je úplné během 30 sekund a plně reverzibilní během několika minut po přidání silného chelátoru.
• reverzibilita interakce umožňuje obnovení vzorku.

Zobrazování jednotlivých molekul - Atto 647N má vynikající fotostabilitu

Podrobněji viz níže.Detekce oligohistidinem značených proteinů často zahrnuje velké populace cílových molekul; další důležitou aplikací metody značení NTA je však zobrazování jediné fluorescenčně značené molekuly v živých buňkách. Při zobrazování jednotlivých molekul jsou fluorescenční značky vystaveny silnému ozáření. Za těchto podmínek podléhá většina běžných značek poměrně rychlé fotodestrukci, což omezuje počet snímků, které lze získat. Obvykle lze při širokoúhlém osvětlení získat 10-25 snímků, než dojde k vybělení, jehož výsledkem jsou krátké stopy posunu cílové molekuly. To má následně silný dopad na informace, které lze získat. Například analýza středního kvadratického posunu molekuly, u níž bylo zaznamenáno n snímků, bude obsahovat [1+ ...+ (n-1)] datových bodů. Například jedna stopa složená z 30 snímků poskytne desetkrát více datových bodů než stopa složená z 10 snímků.

Atto 647N má velký potenciál pro studium jednotlivých molekul díky své velké fotostabilitě a jasu. Ve srovnávacím experimentu byl ionotropní serotoninový receptor exprimovaný v savčích buňkách značen buď sondou Cy™5, nebo sondou Atto 647N. Zobrazování jednotlivých molekul ukázalo, že Atto 647N je fotostabilnější než Cy5 a má 2krát nižší rychlost blednutí (obrázek 2). Sonda Atto 647N běžně umožňovala pořízení filmů o 50 až 100 snímcích.

Obrázek 2. Atto 647N (zelený) je fotostabilnější než Cy5 (červený).

Horní panel: Kumulativní počet datových bodů na molekulu pozorovaný u molekul značených Cy5 dosahuje přibližně 200 pro maximální délku 55 snímků. Atto 647N však poskytuje 3krát více datových bodů díky délce stopy až 85 snímků.

Dolní panel: Histogram délky stopy pro sondu serotoninového receptoru značenou Cy5 (červeně) a Atto 647N (zeleně) ukazuje, že Cy5 podléhá fotoblednutí dvakrát rychleji než Atto 647N.

Atto 647N poskytuje velmi dlouhé stopy difundujících jednotlivých molekul

Filmy s dlouhými stopami umožňují přesný popis difuzního chování jednotlivých značených molekul. Rutinně se u filmů s krátkými stopami vyhodnocuje difuzní chování vynesením grafu středního kvadratického posunu (MSD) pozorovaného v sérii relativně krátkých filmů, každý v rozsahu 12 snímků, pro populaci molekul v závislosti na čase (obrázek 3A). V závislosti na typu difúze je zjištěna odlišná závislost MSD na čase.

Vynikající vlastnosti přístroje Atto 647N umožňují získat sekvence snímků až do přibližně 100 snímků (příklad 104 snímků je uveden na obrázku 3B). Stopy této délky umožňují vyhodnotit MSD jednotlivých částic a odhalit detaily jejich difúzního chování. Pokud by se pořízení omezilo pouze na 12 snímků, pak by se dospělo k závěru, že difúze částice probíhá v omezené oblasti (ohraničení). Vyhodnocení delší stopy jasně ukazuje na volnou Brownovu difúzi (obrázek 3C).

Tato pozorování jsou výrazně usnadněna použitím velmi fotostabilních a jasných fluoroforů, jako je Atto 647N.

Vyhodnocení difúze sledování jednotlivých molekul

Obrázek 3a.

Střední kvadratický posun (MSD) cílových molekul s různými způsoby difuze. Volně difundující molekuly mají MSD (D=1) úměrný času: MSD ∝ tⁿ⁼¹. Molekuly, jejichž difúzi brání překážky (D<1) nebo jsou omezeny na určitou oblast (confined), mají MSD ∝ t^n<1. Molekuly, které se pohybují s proudem nebo jsou směrově transportovány, vykazují MSD ∝ t^n>1.

Obrázek 3b. Stopa jedné molekuly serotoninového receptoru značeného NTA-Atto 647 v plazmatické membráně buňky HEK293 (měřítko je 250 nm). Pro tuto jedinou molekulu bylo zaznamenáno 104 snímků.

Obrázek 3c. Střední kvadratický posun (MSD) stopy zobrazené na obrázku 3B., což naznačuje, že tato molekula podléhá volnému difuznímu chování.