Vlastní primery LAMP ve spolupráci s New England Biolabs

• Design primerů pro lampy
• Zajištění kvality
• SARS-CoV-2 Targets
• References

V kombinaci s detekcí v reálném čase je LAMP (loop-mediated isothermal amplification) oblíbenou technologií izotermické amplifikace, která se používá k vytvoření COVID-19 molekulární diagnostiky. Důvodem je pravděpodobně mimo jiné to, že LAMP, konkrétně RT-LAMP (reverzní transkripční LAMP) v případě SARS-CoV-2, je robustní metoda specifické detekce nukleových kyselin.

Přestože jsou tyto metody robustní, je stále nejlepší optimalizovat reakci i její složky. To platí zejména s ohledem na to, že LAMP je dobře známá tím, že produkuje falešné amplikony, které mohou vést k falešně pozitivním výsledkům¹. Zatímco optimalizace reakce je na vývojáři testu, prodejci musí vést cestu optimalizace komponent.

Polymeráza vytěsňující vlákna, např. Bst DNA polymeráza, která katalyzuje reakci LAMP, je důležitou složkou, jejíž vlastnosti podléhají přímému zlepšování, např. pomocí mutageneze řízené na místě². Rychlým a nepřímým způsobem, jak "vylepšit polymerázu", je vylepšení další neméně důležité složky, primerů. Nejlepším způsobem, jak toho dosáhnout, je vyladit purifikační metody používané ve výrobním procesu (obrázek 1). Běžná je buď desaltová, nebo HPLC purifikace oligonukleotidů LAMP a často je možné obě metody upravit tak, aby vznikly optimalizované primery.

Primery LAMP na zakázku, odvozené od našich iScale Oligos™, jsou určeny k maximalizaci funkce primerů LAMP v testech, které mají být použity jako nástroje pro výzkum v oblasti přírodních věd, molekulární diagnostiku a laboratorně vyvinuté testy.

Obrázek 1. Přehled hlavních kroků používaných ve výrobním procesu vlastních primerů LAMP (kroky před syntézou a za purifikací byly pro zjednodušení vynechány).

Návrh primerů LAMP

Základní informace o návrhu primerů LAMP na zakázku a přístup k bezplatnému nástroji pro návrh naleznete ve vynikajících zdrojích dostupných na New England Biolabs.
 

Výhody produktu

• K dispozici jsou množství vyhovující potřebám od výzkumu a vývoje až po komercializaci
• Konzultace s naším vědeckým týmem při stanovení konečných specifikací
• Specializované čištění zajišťující vysoce výkonné primery

Vlastnosti produktu

V případě čehokoli označeného níže jako "Dotaz" nebo pokud máte potřeby, které se liší od ostatních uvedených obecných specifikací, zašlete prosím požadavek na dnaoligos@sial.com.

Zajištění kvality

Základem našich výrobních procesů je robustní Systém řízení kvality (QMS), který řídí dodržování našich následujících Registrace kvality:

• ISO 9001:2015 pro výrobu oligonukleotidů pro výzkum
• ISO 13485:2016 pro výrobu oligonukleotidů pro diagnostiku
• ISO 14001:2015 pro efektivní environmentální řízení

Primery LAMP pro SARS-CoV-2

Kromě toho, že se jedná o robustní metodu, jak je popsáno výše, obliba kolorimetrické RT-LAMP jako molekulární diagnostiky rychle roste, zejména pro SARS-CoV-2, protože umožňuje rychlou detekci s minimálním přístrojovým vybavením. V současné době používá několik testů EUA (Emergency Use Authorization) primery uvedené v tabulce 1, které jsou popsány v článku, Zvýšení rychlosti a citlivosti kolorimetrické smyčkové izotermické amplifikace pomocí guanidinchloridu³. Přímé testování několika koncovými uživateli ukázalo, že naše vlastní primery LAMP vedly k výjimečnému výkonu se sadami primerů E1, N2 a As1e.

*Typické poměry primerů znamenají, že FIP/BIP musí být přítomny 8-10krát více než F3/B3 a LF/BF musí být přítomny 2krát více, aby chemie LAMP fungovala správně.

Odkazy

1. Jiang YS, Bhadra S, Li B, Wu YR, Milligan JN, Ellington AD. 2015. Robust Strand Exchange Reactions for the Sequence-Specific, Real-Time Detection of Nucleic Acid Amplicons. Anal. Chem.. 87(6):3314-3320. https://doi.org/10.1021/ac504387c

2. Maranhao A, Bhadra S, Paik I, Walker D, Ellington AD. An improved and readily available version of Bst DNA Polymerase for LAMP, and applications to COVID-19 diagnostics. https://doi.org/10.1101/2020.10.02.20203356

3. Zhang Y, Ren G, Buss J, Barry AJ, Patton GC, Tanner NA. 2020. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69(3):178-185. https://doi.org/10.2144/btn-2020-0078

4. Huang X, Tang G, Ismail N, Wang X. 2022. Developing RT-LAMP assays for rapid diagnosis of SARS-CoV-2 in saliva. eBioMedicine. 75103736. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103736

Technickou pomoc vám poskytne naše skupina technických služeb.