Vitamin B12, kobalamin, v buněčných kulturách

Dennis R. Conrad, Ph.D.

biomediaexpert@earthlink.ne

Význam a použití vitaminu B₁₂ v bezsérových eukaryotických, včetně hybridomových a ovariálních buněčných kulturách čínských křečků (CHO)

Vitamin B₁₂/sub>, doplněk bezsérového média, použitelný v biovýrobě, tkáňovém inženýrství a speciálních médiích

Kulturní buňky vyžadují pM hladiny fyziologického vitaminu B₁₂. Koncentrace doplňku vitaminu B₁₂ se pohybují v rozmezí 0 až 7,4 µM v nechráněných komerčně dostupných klasických médiích. Většina klasických médií byla vyvinuta se séry, zejména FBS, jako standardními doplňky. Séra obsahují vitamin B₁₂. Množství vitaminu B₁₂ přítomného v sérech se však liší u různých druhů a při skladování a manipulaci. Rozdíly v množství vitaminu B₁₂ přítomného v sérech částečně vysvětlují široký rozsah vitaminu B₁₂ zjištěný v klasických mediálních přípravcích. Chemická nestabilita vitaminu B₁₂ v médiích pro buněčné kultury také přispívá k širokému rozmezí hladin suplementace.

Následující klasická média neobsahují ve svém základním složení žádný vitamin B₁₂: Amesovo médium; základní médium Eagle (BME); Clickovo médium; médium CMRL-1066: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM); Fischer's Medium; Glascow Modified Eagle's Medium (GMEM);L-15 Medium; Medium 199; Minimum Essential Medium, Eagle (EMEM); a Swim's S-77 Medium.

NCTC Medium obsahuje velmi vysoké množství vitamínu B₁₂, 7.4 µM.

Prostředí RPMI-1640 a Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) obsahují ve srovnání s ostatními doplněnými médii nízké hladiny vitaminu B₁₂, a to 3,7 a 9,6 nM. Alpha-MEM obsahuje 100 nM vitaminu B₁₂. IMDM a alfa-MEM jsou modifikace bazálních médií, které neobsahují žádný vitamin B₁₂. Waymouthovo médium MB a Williamsovo médium E obsahují 148 nM vitaminu B₁₂. Médium H-Y (Hybri-Max^®) a modifikované médium McCoy's 5A obsahují 923 nM a 1,48 µM vitaminu B₁₂. Vysoký obsah vitaminu B₁₂ v médiu H-Y (Hybri-Max^®) pochází z jeho složky NCTC.

DMEM/Ham's Nutrient Mixture F-12 (50:50) je základní médium, které se často používá jako základ pro vývoj patentovaných bezsérových nebo bezproteinových buněčných kultivačních médií používaných pro biomanufacturing heterologních proteinů, zejména s buňkami vaječníků čínského křečka (CHO). Obsahuje 501 nM vitaminu B₁₂, který pochází z jeho složky F-12. Nutrient Mixture, Ham's F-10 a Nutrient Mixture, Ham's F-12 byly vyvinuty pro klonální růst buněk CHO bez použití FBS. Tato média a jejich deriváty: F-12 Coon's Modification; Nutrient Mixture Ham's F-12, Kaighn's Modification (F12K) a Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium obsahují 1 µM vitaminu B₁₂.

Hladina vitaminu B₁₂ v médiích řady MCDB byla upravena na jednu ze dvou koncentrací: média 105, 110, 131, 201 a 302 obsahují 100 nM a média 151 a 153 obsahují 300 nM vitaminu B₁₂.

Relativně vysoká hladina vitaminu B₁₂ v bezsérových hybridomových médiích; Hybri-Max^® a Serum-Free/Protein Free Hybridoma Medium naznačuje, že bezsérové systémy pro produkci monoklonálních protilátek vyžadují významné doplnění médií vitaminem B₁₂. Buňky v kultuře vyžadují fyziologický vitamin B₁₂ v koncentračním rozmezí pM. Přítomnost vitaminu B₁₂ v základních médiích v množství nm a µM naznačuje, že jeho dodávání prostřednictvím médií pro buněčné kultury je složité. Největší problém u bezsérových přípravků může souviset s chemickou nestabilitou vitaminu B_12. Úplnější diskusi o vitaminu B₁₂ jako doplňku médií pro buněčné kultury naleznete v části Media Expert.

Primární funkce vitaminu B₁₂ v médiích pro buněčné kultury

Vitamin B₁₂ je obecný název pro skupinu molekul kobalaminu potřebných pro růst, genetickou stabilitu a přežití buněk in vitro. Členové této rodiny jsou vzájemně zaměnitelní a mají různé axiální ligandy a oxidační úrovně kobaltu. Jako jedinečné koenzymy methioninsyntázy (EC 2.1.1.13) a methylmalonyl-CoA mutázy (EC 5.4.99.2) podporují kobalaminy vitaminu B₁₂, methylkobalamin a 5'-adenosylkobalamin, metabolismus jednoho uhlíku a odbourávání aminokyselin, respektive mastných kyselin s lichým řetězcem. Nedostatek vitaminu B₁₂ in vitro může přispívat k acidóze, nestabilitě genomu a apoptóze zprostředkované mitochondriemi.

Jedouhlíkový metabolismus:

Methioninsyntáza (MS) je regulovaný enzym, který propojuje methylační dráhu buňky methionin:S-adenosylmethionin (SAM) s její dráhou přenosu jednoho uhlíku zprostředkovanou foláty. Jedná se o cytoplazmatický enzym obsahující methylkobalamin, který metyluje homocystein na methionin a přeměňuje N5-methyltetrahydrofolát na tetrahydrofolát. MS zabraňuje hromadění methylových skupin ve formě N5-methyltetrahydrofolátu, pasti na methylfolát, tím, že regeneruje tetrahydrofoláty (THF). Selhání regenerace THF může vést k narušení syntézy nukleových kyselin. N5-methyl THF je převládajícím folátem přítomným v plazmě. MS řídí tok metylových skupin přenášených foláty do primární metylační dráhy buňky, dráhy methionin:S-adenosylmethionin (SAM).

S-adenosylmethionin (SAM):

S-adenosylmethionin (SAM) je důležitý pro funkci a přežití buněk. Podílí se na několika důležitých metabolických procesech včetně transmetylace, transsulfurace a syntézy polyaminů.

SAM daruje metylové skupiny různým molekulám včetně malých molekul, proteinů, fosfolipidů a nukleových kyselin. Bylo identifikováno a charakterizováno velké množství unikátních SAM:methyltransferáz. Jejich přenos metylových skupin SAM do bází DNA a RNA je důležitý pro regulaci genové exprese, opravy DNA a stabilitu genomu.

SAM podporuje tvorbu kreatinu, prekurzoru kreatinfosfátu, z kvanidinoacetátu.

Polyaminy jsou nezbytné pro řadu buněčných funkcí včetně buněčné proliferace a diferenciace. Růst a přežití buněk je citlivé na velikost a složení intracelulárních polyaminových poolů. Pokud je koncentrace polyaminů příliš nízká, dochází k zastavení růstu buněk. Pokud je koncentrace polyaminů příliš vysoká, mohou buňky vstoupit do apoptózy. Biosyntéza polyaminů je úzce regulována enzymy ornitin dekarboxylázou (ODC) a S-adenosylmethionin dekarboxylázou (SAM-DC). ODC řídí tvorbu putrescinu a SAM-DC řídí tvorbu spermidinu a sperminu. Syntéza spermidinu a sperminu z putrescinu vyžaduje donaci aminopropylových skupin z dekarboxylovaného S-adenosylmethioninu, který se tvoří ze SAM pomocí S-adenosylmethionin dekarboxylázy (SAMe-DC) (EC 4.1.1.50).

SAM může být také vícestupňově katabolizován na L-cystein, který je důležitým prekurzorem antioxidačních molekul glutathionu, taurinu a hypotaurinu. I když je methionin přímým prekurzorem SAM, přidávání methioninu přímo do buněk není vhodné, protože pokud není enzym methionin-syntáza aktivní, může methionin způsobit nahromadění homocysteinu a S-adenosylhomocysteinu, které mohou být pro buňky toxické.

Apoptóza: Methionin:

Přenosem methylových skupin ze SAM na buněčné substráty metyltransferázou vzniká S-adenosylhomocystein (SAH). SAH je přeměněn na homocystein (HCys), který je poté metylován metylovými skupinami získanými z folátového poolu na methionin pomocí methioninsyntázy. Methionin je adenosylován na SAM. Tento cyklus přivádí methylové skupiny z methylového fondu folátů do metylačních drah buňky, které podporují genovou expresi a opravu DNA. Pokud není MS aktivní, může docházet k hromadění homocysteinu i S-adenosylhomocysteinu a k indukci apoptózy. Pokud se L-homocystein hromadí v buňkách s nefunkční methioninsyntázou, může zvrátit reakci adenosylhomocysteinázy (EC 3.3.1.1) a vytvořit SAH, inhibitor methylace DNA. Adenosin bude tuto reakci pohánět směrem k SAH. Adenosin a cAMP vážou adenosylhomocysteinázu. Při zvýšení poměru SAH/SAM dochází k hypometylaci DNA, což může vést k nestabilitě DNA. Enzym poly-ADP-ribóza polymeráza (PARP) je důležitým enzymem pro zachování integrity genomu. Jedná se o DNA nick senzor, který využívá NAD(+) k polyribosylaci proteinů zapojených do oprav DNA. Tento enzym se nachází jak v jádře, tak v mitochondriích. ATP a NAD jsou rozhodující pro udržení membránového potenciálu mitochondrií. Za podmínek oxidačního stresu nebo poškození DNA může PARP vyčerpat ATP a NAD+ v mitochondriích, což vede k destabilizaci membrány a apoptóze zprostředkované mitochondriemi. Přídavek adenosinu nebo cAMP do média může přispět k apoptóze, pokud je aktivita methionin syntázy nízká v důsledku nedostatku kobalaminu. Úroveň a účinek adenosinu na tvorbu SAH bude také záviset na aktivitě adenosinkinázy, která odstraňuje adenosin jako substrát.

Metabolismus proprionyl-CoA:

Proprionyl-CoA vzniká v mitochondriích β-oxidací mastných kyselin s lichým řetězcem a katabolismem aminokyselin; isoleucinu, valinu, treoninu, homocysteinu a methioninu. Proprionyl-CoA je katabolizován na sukcinyl-CoA třemi enzymy: proprionyl-CoA karboxylasou (EC 6.4.1.3), (S)-methylmalonyl-CoA isomerasou a (R)-methylmalonyl-CoA mutasou (EC 5.4.99.2). MM-CoA-M dokončuje tvorbu sukcinyl-CoA z proprionyl-CoA. Deacylace sukcinyl-CoA na sukcinát je doprovázena tvorbou GTP. V živočišných buňkách se velká část tohoto GTP přeměňuje na ATP pomocí nukleosid difosfokinázy. Tento proces se nazývá substrátová fosforylace. Podporuje tvorbu ATP bez účasti kyslíku. Buňky, kterým chybí vitamin B₁₂, nemohou získávat energii ve formě sukcinátu a ATP z mastných kyselin s lichým řetězcem a aminokyselin tvořících proprionyl-CoA. Pokud je MM-CoA-M neaktivní, může se methylmalonyl-CoA hromadit a způsobit acidózu.

Přenos a metabolismus kobalaminu:

Přenos kobalaminu:

Vitamin B₁₂ je obecný název pro skupinu kobalaminů (Cbl), které obsahují různé koordinované ligandy. Nutriční formy vitaminu B₁₂ jsou axiálně vázané molekuly Cbl(III)alaminu kyano-Cbl, aquo-Cbl a hydroxo-Cbl, viz chemie. Tyto formy kobalaminu jsou do buněk transportovány jako komplexy s transkobalaminem-II a internalizovány specifickými receptory pro transkobalamin-II, TC-IIR. Mnoho buněk syntetizuje a vylučuje apoTC-II do média a aktivita TC-IIR se obecně zvyšuje při přechodu buněk do aktivního dělení. Uvnitř buňky je komplex Cbl(III)alamin:TC-II transportován do lysozomů, kde se z TC-II uvolňuje ligand obsahující:Cbl(III)alamin. Následně Cbl(III)alamin prochází axiální výměnou ligandů a redukcí na Cbl(II)alamin pomocí Cbl(III)alamin reduktáz vázaných na NADH nebo NADPH, jako jsou kyanokob(III)alamin, hydroxokob(III)alamin a aquacob(III)alamin reduktázy (EC 1.6.99.8, vázaná na NADH; EC 1.16.1.3, vázaná na NADH nebo EC 1.16.1.5, vázaná na NADPH). Bylo prokázáno, že cytoplazmatický enzym glutathionyl ligand transferáza přeměňuje CN-, aquo- a hydroxokobalaminy na glutathionylkobalamin. Glutathionylkobalamin může být preferovaným prekurzorem pro tvorbu koenzymů, methylkobalaminu a 5'adenosylkobalaminu. Glutathionylkobalamin je relativně stabilní forma kobalaminu tvořená uvnitř buňky s vysokou afinitou ke kobalaminreduktázám, které jej přeměňují na kob(II)alamin. Cbl(II)alamin se buď váže na methioninsyntázu v cytoplasmě, kde je aktivován další redukcí a methylací na methylkobalamin, nebo vstupuje do mitochondrií, kde je redukován na cbl(I)alamin, substrát pro cob(I)alamin adenosyltransferázu (EC 2.5.1.17). Tento enzym tvoří 5'adenosylkobalamin z ATP a cob(I)alaminu

In vitro kultury:

Zvýšená potřeba methioninu transformovanými a stimulovanými buňkami vyžaduje jak externí suplementaci, tak interní syntézu. Dělící se lymfocyty a jiné mononukleární buňky mají zvýšenou závislost na kobalamin obsahující methionin syntázu. Aktivně se dělící buňky jsou závislé na aktivitě methionin syntázy, aby mohly růst a udržovat integritu genomu. Účinná koncentrace kobalaminu závisí na formě jeho podání. Nejúčinnější formou podání je kobalamin vázaný na transkobalamin II.

Chemické vlastnosti vitaminu B₁₂, které z něj činí užitečný doplněk stravy bez použití séra

Kobalaminy jsou molekuly rozpustné ve vodě, které neprocházejí účinně buněčnými membránami. Do buněk obvykle vstupují jako komplex s transkobalaminem II nebo v případě enterocytů ve střevě s vnitřním faktorem.

Kobalamin se skládá ze dvou částí: nukleotidu, 5,6 dimethylbenzimidazolu a kobaltem koordinovaného vysoce substituovaného a redukovaného korrinového kruhu. Korrin-kobalt tvoří až šest koordinačních vazeb s oktaedrickou symetrií. Čtyři z těchto vazeb jsou v rovině a dvě jsou v axiální orientaci. Rovinné koordinační vazby kobaltu chelatují čtyři nitrogeny korrinového kruhu. Jedna axiální koordinační vazba chelatuje imidazolový dusík nukleotidu a druhá axiální vazba může být volná nebo obsazená různými ligandy. Pokud je axiální vazebná pozice neobsazená, jsou kobalaminy obecně v oxidačních stavech cob(I)alamin nebo cob(II)alamin. Pokud tato vazba obsahuje ligand, ovlivňuje stupeň oxidace kobaltu reaktivitu molekuly. Oxidační stupeň nutričních kobalaminů a koenzymových kobalaminů je obecně cob(III)alamin.

Kobalaminy jsou rodinou molekul s různými ligandy na výměnné axiální koordinační vazbě kobaltu a s různými oxidačními stupni kobaltu. Vitamin B₁₂ je obecný termín, který označuje živné formy kobalaminu. Kobalt v živných kobalaminech je obvykle oxidován na Co(III)alamin a jeho axiální vazba je ligována na kyanid, vodu nebo hydroxylovou skupinu. Při komerční výrobě vzniká kyanokobalamin. In vivo může být tvorba kyanokobalaminu skutečně mechanismem obrany proti otravě kyanidem. Uvnitř buňky jsou tyto ligandy nahrazeny glutathionem nebo odstraněny redukcí kobaltu na Co(II)alamin a Co(I)alamin. Formy kobalaminu Co(II)alamin a Co(I)alamin jsou prekurzory koenzymů methylkob(III)alaminu a 5'adenosyl(III)kobalaminu.

Stabilita kobalaminu:

Sérum vitaminu B₁₂ je vysoce nestabilní a že by mělo být chráněno před světlem a uchováváno ve zmrazeném stavu. Kyanokobalamin se často používá k doplnění médií. Má maximální stabilitu při pH = 7, ale fotolyzuje se na hydroxokobalamin s rychlostní konstantou nulového řádu. Hydroxokobalamin se může v přítomnosti oxidu siřičitého nebo jiných siřičitanů přeměnit na sulfitokobalamin. Hydroxokobalamin se může přeměnit na amoniakobalamin, je-li přítomen amoniak. Ve vodných okysličených systémech tvoří Cbl(III)alamin rychle a spontánně stabilní komplex superoxokobalamin, Cbl(III)-O₂^-. Superoxokobalamin reaguje s oxidem dusnatým, NO, za možné tvorby peroxynitritu, OONO^-, prekurzoru volných radikálů a oxidu dusnatého. Nízké μM koncentrace NO-Cbl mohou vyvolat apoptózu, zejména u rychle se dělících buněk. Oxid dusný (N₂0) může inhibovat kobalaminový enzym methioninsyntázu. Dusitany, NO₂, se vážou na Cbl(III) a Cbl(II).

in vitro chemie kobalaminu je velmi složitá a existuje vysoký potenciál pro to, aby se kobalamin stal neaktivním a/nebo se účastnil chemických reakcí. Může se účastnit široké škály radikálových redoxních reakcí s molekulami kyslíku, dusíku a síry a mnohé z těchto reakcí mohou vytvářet toxické formy.

Produkty vitaminu B₁₂, které zvyšují růst hybridomů, vaječníků čínského křečka (CHO) a dalších savčích eukaryotických buněk v bezsérových kulturách

.