Základy buněčných kultur: Kryokonzervace a skladování buněčných linií.

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Kryokonzervace buněčných linií

Cílem kryokonzervace neboli zmrazení buněk je umožnit skladování zásob buněk, aby se předešlo nutnosti mít všechny buňky v mrazicím boxu.nbsp;
buněčné linie v kultuře po celou dobu. Je neocenitelná při práci s buňkami s omezenou životností. Dalšími hlavními výhodami kryokonzervace jsou:

• Snížené riziko mikrobiální kontaminace
• Snížené riziko křížové kontaminace s jinými buněčnými liniemi
• Snížené riziko genetického driftu a morfologických změn
• Práce prováděná s použitím buněk s konstantním počtem pasáží
• Konzervace v kryokonzervačním zařízení je vhodná pro všechny typy buněk.(viz oddíl 8 "Správná praxe buněčného bankovnictví")
• Snížené náklady (spotřební materiál a čas personálu)

Bylo provedeno velké množství vývojových prací k zajištění úspěšné kryokonzervace a resuscitace široké škály buněčných linií různých buněčných typů. Základním principem úspěšné kryokonzervace a resuscitace je pomalé zmrazení a rychlé rozmrazení. Ačkoli se požadavky mohou u jednotlivých buněčných linií lišit, obecně platí, že buňky by měly být zchlazovány rychlostí -1 °C až -3 °C za minutu a rychle rozmrazovány inkubací ve vodní lázni o teplotě 37 °C po dobu 3-5 minut. Při dodržení tohoto postupu a dalších níže uvedených bodů by měla být většina buněčných linií úspěšně kryokonzervována.

1. Kultury by měly být zdravé s životaschopností >90 % a bez známek mikrobiální kontaminace.
2. Kultury by měly být v logaritmické fázi růstu (toho lze dosáhnout použitím prekonfluentních kultur, které jsou pod svou maximální hustotou buněk, a výměnou kultivačního média 24 hodin před zmrazením).
3. Měla by být použita vysoká koncentrace séra/proteinu  (>20 %). V mnoha případech se používá sérum v koncentraci 90 %.
4. Použijte kryoprotektivum, například dimetylsulfoxid (DMSO). nebo glycerol k ochraně buněk před prasknutím tvorbou ledových krystalků. Nejčastěji používaným kryoprotektivem je DMSO v konečné koncentraci 10 %. To však není vhodné pro všechny buněčné linie, například když se DMSO používá k navození diferenciace. V takových případech je třeba použít alternativu, například glycerol (podrobnosti o správném kryoprotektantu naleznete v datovém listu ECACC). Nabízíme hotové média pro zmrazování buněk obsahující DMSO, glycerol a přípravky bez séra obsahující DMSO.
5. Pomalé zmrazování, snižování teploty přibližně o 1 °C za minutu, pomocí Nalgene Mr. Frosty Freezing Container nebo Corning Cool Cell Freezing Container může napomoci úspěšné kryokonzervaci buněk.

Obrázek 1. Mechanismus kryokonzervace buněk. Jako kryoprotektanty pro buňky lze do médií pro kultivaci buněk přidávat kryoprotektanty, jako je DMSO nebo glycerol. DMSO snižuje tvorbu ledových krystalů, a tím zabraňuje odumírání buněk během procesu zmrazování. Přibližně 10 % v/v lze použít při metodě pomalého zmrazování (snižování teploty přibližně o 1 °C za minutu) a buňky lze zmrazit při teplotě -80 °C (-112 °F) nebo uchovávat v kapalném dusíku po delší dobu.

Skladování buněčných linií při velmi nízkých teplotách

Po řízeném zmrazení za přítomnosti kryoprotektantů lze buněčné linie kryokonzervovat v pozastaveném stavu po neomezeně dlouhou dobu za předpokladu, že je udržována teplota nižší než -135 °C. Takto ultranízkých teplot lze dosáhnout pouze pomocí specializovaných elektrických mrazicích zařízení nebo obvykle ponořením do kapalné nebo parní fáze dusíku. Výhody a nevýhody lze shrnout takto:

Skladování v kapalné fázi dusíku umožňuje udržovat nejnižší možnou skladovací teplotu s absolutní stálostí, ale vyžaduje použití velkých objemů (hloubky) kapalného dusíku, což představuje potenciální nebezpečí. Byly také zdokumentovány případy křížové kontaminace virovými patogeny prostřednictvím média s kapalným dusíkem. Z těchto důvodů se ultranízké teploty nejčastěji skladují v plynné fázi dusíku.

Při skladování v plynné fázi dusíku jsou ampule umístěny nad mělkým zásobníkem kapalného dusíku, jehož hloubka musí být pečlivě udržována. V plynné fázi bude existovat vertikální teplotní gradient, jehož extrémní hodnoty budou záviset na udržovaných hladinách kapaliny, konstrukci nádoby a četnosti jejího otevírání. Pokud není prováděna pravidelná údržba, mohou být teplotní rozdíly v horních oblastech skladovací nádoby s parní fází extrémní. Moderní konstrukce nádob na skladování kapalného dusíku stále častěji nabízejí zdokonalenou technologii skladování v plynné fázi.

Ztráta celých zásob buněk v důsledku nedostatečné údržby skladování je znepokojivě častá. Všechny nádoby na skladování kapalného dusíku by měly být minimálně vybaveny alarmy, které upozorňují na nízkou hladinu kapalného dusíku, a měly by být také neustále monitorovány a signalizovány teplotou. To platí zejména pro systémy skladování v plynné fázi. Nádoba na skladování volně loženého kapalného dusíku by neměla být před doplněním zásob naplněna z méně než poloviny. Tím se zajistí, že alespoň jedna dodávka kapalného dusíku může být vynechána bez katastrofických následků. Důrazně se doporučuje, aby zásoby cenných buněk byly zálohovány skladováním na druhém místě. ECACC za tímto účelem nabízí službu bezpečného uložení.

Obrázek 2. Běžné zásobníky kapalného dusíku používané pro kryokonzervaci buněk.

Kontrola inventáře buněčné linky

Všechny nádoby pro skladování při ultranízkých teplotách by měly obsahovat regálový / inventární systém určený k uspořádání obsahu pro snadné umístění a vyhledání zmrazených kryovaků.To by mělo být podpořeno přesným vedením záznamů a kontrolou inventáře zahrnující následující prvky:

• Každá ampule by měla být samostatně označena štítky odolnými vůči kapalnému dusíku, na kterých by měla být uvedena identifikace, číslo šarže, číslo průchodu a datum zmrazení.
• Umístění každé ampule by mělo být zaznamenáno nejlépe v elektronické databázi nebo tabulce, ale také v papírovém plánu skladování.
• Měl by existovat kontrolní systém, který zajistí, že žádná ampule nemůže být uložena nebo odebrána bez aktualizace záznamů.

Bezpečnostní aspekty kapalného dusíku

Všeobecné bezpečnostní otázky

Je důležité, aby byl personál vyškolen v používání kapalného dusíku a souvisejícího vybavení, včetně skladovacích nádob, které je třeba bezpečně odvzdušnit, a nádob, které může být nutné naplnit. Stejně jako při všech laboratorních postupech by měly být při manipulaci s dusíkem vždy používány osobní ochranné prostředky, včetně celoobličejového štítu a tepelně izolovaných rukavic, dále laboratorní plášť a nejlépe plastová zástěra odolná proti stříkající vodě. Řádné školení a používání ochranných pomůcek minimalizuje riziko omrzlin, popálenin a dalších nežádoucích událostí.

Riziko udušení

Nejdůležitějším bezpečnostním aspektem je potenciální riziko udušení, když se uniklý dusík vypaří a vytlačí atmosférický kyslík. To je kritické, protože úbytek kyslíku může velmi rychle a bez varování způsobit ztrátu vědomí. Chladničky na kapalný dusík by proto měly být umístěny v dobře větraných prostorách, aby se toto riziko minimalizovalo, a měly by podléhat plánované preventivní údržbě. Velkoobjemové sklady by měly být vybaveny poplašným systémem pro nízkou hladinu kyslíku.

Preventivní opatření pro vyhrazené prostory pro skladování kapalného dusíku

• Používejte kyslíkové alarmy nastavené na 18 % kyslíku (v/v)
• Školení personálu - personál by měl být vyškolen, aby při zaslechnutí alarmu okamžitě opustil prostor a nevracel se, dokud se kyslík nevrátí na normální úroveň (~ 20 % v/v)
• Při manipulaci s kapalným dusíkem by měl personál pracovat ve dvojicích
• Zakázat používání dusíku mimo běžnou pracovní dobu
• Pokud je to možné, měly by být instalovány mechanické ventilační systémy