Nově vyvinutý porézní grafitický uhlík v U/HPLC

C. Corman, HPLC R&D Sr. Scientist, C. Muraco, Global Product Manager Liquid Chromatography Technologies, M. Ye, HPLC R&D Manager, C. Frantz, HPLC R&D Sr. Scientist, W. Maule, HPLC R&D Sr. Scientist

Článek z Analytix Reporter - číslo 10

Úvod

Od 60. let 20. století dominují ve vědecké disciplíně vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) technologie kolon na bázi částic oxidu křemičitého. Vědecká literatura se hemží informacemi o použití kolon s nepravidelnými křemennými částicemi z 60. a 70. let 20. století až po současné povrchově porézní částice (SPP), plně porézní částice o velikosti pod 2 µm (FPP) a monolity na bázi oxidu křemičitého. Ačkoli každá z těchto různých modalit částic má své výhody a nevýhody, obecně mají všechny balené kolony na bázi oxidu křemičitého tři společné nedostatky:

1. omezený rozsah pH pro stabilitu vázané fáze
2. omezený rozsah teplot pro stabilitu vázané fáze a
3. sekundární interakce aktivních silanolových forem (i když to může být výhoda, pokud je třeba vyvolat rozlišení pomocí iontových interakcí).

V počátcích chromatografie využívala kapalinová chromatografie (LC) uhlíkové částice. Vzhledem k nelineárním adsorpčním izotermám, které vytvářely tehdy dostupné aktivní uhlíkové částice, však nebyly považovány za vhodné pro aplikace HPLC.¹ Koncem 70. a v 80. letech 20. století výzkumníci optimalizovali porézní částice grafitického uhlíku (PGC) pro méně aktivní povrchy, což vedlo ke komercializaci HPLC s uhlíkovými částicemi. V následujících letech došlo k optimalizaci syntetických postupů s cílem snížit velikost částic z 10 µm na 3 µm, což přineslo vyšší účinnost při rozlišení analytů. Nakonec byl v posledních dvou letech vyvinut průlomový, nový syntetický postup, který umožnil vytvořit menší (2,7 µm) uhlíkové částice s užší distribucí velikosti částic (PSD), vyšší mechanickou stabilitou a reprodukovatelností - což vedlo ke zvýšení účinnosti separace náročných analytů.

Polární retence na porézním grafitickém uhlíku (PGC)

Porézní grafitický uhlík nabízí jedinečné retenční mechanismy, které přesahují možnosti standardních nosičů s reverzní fází. Základem pro vývoj PGC byl předpoklad, že nosič složený výhradně z atomů uhlíku se bude chovat jako dokonalá nepolární fáze bez reaktivních silanolových forem. Další výzkum však ukázal, že tomu tak není. Ukázalo se, že retenční vlastnosti PGC se liší od tradičních nepolárních fází.² Studie Möckela a kol. i Tanaky a kol. ukázaly smíšené vlastnosti při srovnání PGC s ODS (C18) fázemi.^3,4 Při porovnávání PGC s ODS výzkumníci zjistili, že v některých případech může změna substituentu bez ohledu na jeho polaritu vyvolat zvýšení retence, zatímco na koloně ODS se retence snižuje. Výzkumníci se domnívali, že za pozorovanými výsledky stojí polarizovatelnost analytů a grafitový povrch. Ross a další také pozorovali podobné chování a pro vysvětlení této charakteristické vlastnosti PGC přišli s termínem PREG (Polar Retention Effect on Graphite).¹ Ačkoli přesný mechanismus tohoto jevu není stále jasný, jejich vysvětlení je stále obecně přijímáno. Tito výzkumníci předpokládali, že tento efekt může být způsoben nerovnoměrným rozložením náboje v analytech v důsledku delokalizovaných elektronů nebo polárních funkčních skupin a vysokou polarizovatelností delokalizovaných elektronů grafitu. To znamená, že když se polární analyt přiblíží k povrchu grafitu, vytvoří indukovaný dipól. Tato interakce je silně závislá na polarizovatelnosti povrchu, rozložení náboje analytu a orientaci funkčních skupin při jejich přiblížení k povrchu grafitu (obrázek 1).

I když vysvětlení PREG je stále nejasné, je zřejmé, že PGC má zvláštní retenční vlastnosti, díky nimž je pro polární sloučeniny vhodnější než standardní přístupy s reverzní fází. Některé klíčové poznatky o schopnosti PGC zadržovat analyty jsou následující:

• PGC se bude pro mnoho analytů chovat v mnoha ohledech stejně jako konvenční ODS fáze.
  • Typicky je třeba použít vyšší procento organických látek v mobilní fázi ve srovnání s ODS.
• Ne každý polární analyt se na PGC silně udrží, ale PGC má tendenci udržet polární sloučeniny silněji než ODS fáze.
  • Důležitým faktorem je velikost a tvar analytu. Rovinné sloučeniny, zejména aromatické, jsou dobrými cílovými analyty, protože orientace může vynutit interakci (příklad zarovnání analytu na obrázku 2).
• Protože PGC může mít různou sílu interakce s analyty na základě jejich elektronového rozložení (velikost, tvar a faktory orientace), může rozlišovat mezi blízce příbuznými sloučeninami, jako jsou izomery nebo podobné sloučeniny s malými rozdíly ve funkčních skupinách.

Obrázek 1. Ilustrace indukované dipólově-dipólové interakce při postupu analytu směrem ke grafitové rovině.

Obrázek 2. Zobrazení zarovnání analytu (červená) s grafitovým povrchem (černá). Analyty, které mohou svou povrchovou plochu vyrovnat do roviny s grafitovou plochou, mají silnější interakci a v důsledku toho mají tendenci se udržet déle. Větší kontakt s plochou povrchu vede k delší retenci než menší kontakt s plochou povrchu. Příkladem je naftalen (vlevo, silnější interakce) vs. triptycen (vpravo, relativně slabší interakce, přestože má jeden aromatický kruh navíc).

Analýza vysoce polárních pesticidů na PGC

Jednou z aplikací, kde může být PGC přínosem, je koeluce polárních analytů v prázdném objemu RP kolony. Jedním z příkladů je analýza náročných polárních pesticidů, jako je glyfosát a příbuzné analogy. Jak je vidět na obrázku 3, použití konvenční ODS kolony, v tomto případě kolony Ascentis^® Express C18, 5,0 cm x 3,0 mm I.D., 2,7 μm, nevede k retenci těchto sloučenin a je pozorována koeluce. V tomto případě byl použit 95:5 voda:acetonitril k ochraně fáze C18 před možným odmáčením. LC kolona Supel™ Carbon však byla schopna zadržet čtyři polární pesticidy (kyselinu aminomethylfosfonovou, glyfosát, glufosinát a acetyl-n-glufosinát) pomocí jednoduchého gradientu s pufrem vhodným pro hmotnostní spektrometrii (obrázek 4).

Retence AMPA, glyfosátu a glufosinátu na koloně ODS o rozměrech 5,0 cm x 3,0 mm x 2,7 μm v poměru 95/5 voda:acetonitril

Obrázek 3. Tři polární pesticidy na stacionární fázi ODS. Nedochází k separaci a sloučeniny se eluují v prázdném objemu kolony nebo v jeho blízkosti.

Čtyři polární aniontové pesticidy na Supel™ Carbon LC

Analýza paraquatu a diquatu na PGC s jednodušším gradientem

PGC může také pomoci zlepšit již existující metodu, která může používat složitější nastavení pufru. Příkladem takové konverze metody je vylepšení metody hydrofilní interakční chromatografie (HILIC) pro separaci dvou polárních herbicidů, paraquatu a diquatu (obrázek 5). 

Obrázek 5. Struktura analytu - (vlevo) paraquat, (vpravo) diquat.

Obvykle se k zadržení obou těchto sloučenin používá některá z forem HILIC (obrázek 6 &tabulka 2) nebo reverzní fáze. Oba herbicidy jsou organické soli, dobře rozpustné ve vodě a nerozpustné ve většině organických rozpouštědel. Obě látky jsou také slabě zadržovány v chromatografii na obrácené fázi (RPC). Metodika RPC navíc vyžaduje párování těžkých iontů, aby se zlepšila síla interakce a tvar píků analytů. HILIC má sice smysl, protože lépe zadržuje hydrofilní druhy než konvenční reverzní fáze, ale stále vyžaduje agresivní pufrování a tvary píků nejsou ideální (obrázek 6).

Obrázek 6. Separace paraquatu a diquatu za podmínek HILIC (Tabulka 2).
 

Vzhledem ke schopnosti PGC zadržovat polární analyty a také ke struktuře analytů se paraquat a diquat snadno zadržují bez nutnosti použití agresivního pufru o koncentraci 200 mM. Obrázek 7 ukazuje zadržení parakvatu a diquatu při použití jednoduchého gradientu a 0,1% kyseliny difluoroctové (DFA) jako modifikátoru (Tabulka 3) pro zlepšení tvaru píku. Rozlišení je znatelně lepší a gradient lze v případě potřeby upravit pro rychlejší analýzu.

Obrázek 7. Separace parakvatu/dikvatu pomocí PGC. Lepšího tvaru píku je dosaženo bez nutnosti použití příliš koncentrovaného pufru. DFA v tomto případě funguje jako párové iontové činidlo. Eluční pořadí: 1) Paraquat -4,362 min 2) Diquat -7,295 min (podmínky tabulka 3).

Analýza metabolitů vitaminů D2 a D3 a jejich epimerů

Nakonec, aplikací, která zdůrazňuje nezbytnost materiálů PGC, je separace vitaminů: konkrétně vitaminu D a jeho metabolitů. Metabolity vitaminu D se používají jako biomarkery pro různé možné chorobné stavy a nedostatek vitaminu. Testy jsou založeny na hladině dvou metabolitů v krvi: 25-hydroxyvitaminu D2 a D3. Bylo zjištěno, že tyto biomarkery mohou být dále metabolizovány cestou C3-epimerizace, čímž vznikají další dvě formy metabolitů, C3-epi-25-hydroxyvitamin D2 a D3 (obrázek 8). Nedávné téma se také soustředilo na to, že epimery mají stejnou biologickou funkci jako neepimery. Je nutné zjistit hladinu epimerů mezi metabolity pomocí LC-MS. Vzhledem k tomu, že epimer a jeho neepimerový metabolit mají stejný poměr m/z, je nutné epimery před detekcí pomocí MS oddělit od odpovídajících neepimerových metabolitů.^5-7

Obrázek 8. Struktura 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 a jejich příslušných epimerů. (A) 25-(OH)-D3 (B) 3-epi-25-(OH)-D3 (C) 25-(OH)-D2 (D) 3-epi-25-(OH)-D2

Z tohoto důvodu je nutné podat žádost o řešení všech čtyř složek. PGC se ukázala jako účinná při rozlišení jak vitaminu D2 a D3, tak i epimerních analogů. Při použití jednoduchého gradientu se silnými organickými mobilními fázemi (Tabulka 4) lze všechny čtyři sloučeniny plně rozlišit v přiměřeném čase analýzy (Obrázek 9).

Obrázek 9. Separace 25-hydroxyvitaminu D2 a D3 a jejich epimerů na Supel™ Carbon LC. Eluční pořadí:
1) 3-epi-25-(OH)-D3 - 8,294 min;
2) 25-(OH)-D3 - 9,125 min;
3) 3-epi-25-(OH)-D2 - 11,126 min;
4) 25-(OH)-D2 - 12,062 min.

Závěr

Porézní grafitický uhlík je nová stacionární fáze a dává chromatografům další chemickou možnost při separaci náročných sloučenin, která přesahuje oblast konvenční chromatografie na bázi oxidu křemičitého s reverzní fází. Ačkoli se PGC může v mnoha ohledech chovat jako kolona s obrácenou fází, nabízí také výhody v podobě zvýšené teplotní stability, stability rozpouštědla a pH. Navíc díky jedinečným vlastnostem grafitu lze na koloně PGC udržet vysoce polární sloučeniny (které mohou vyžadovat podmínky HILIC nebo iontové výměny). Ačkoli mechanismy retence ještě nebyly objasněny, je zřejmé, že PGC má jedinečné retenční vlastnosti vůči polárním sloučeninám - zejména planárním molekulám nebo analytům s konjugací dvojných vazeb, které mohou interagovat s elektronovým mrakem grafitu. PGC je jedinečnou stacionární fází mezi konvenčnějšími stacionárními fázemi HPLC a další pokroky v konstrukci částic PGC mohou vést k ještě lepší rozlišovací schopnosti pro širší škálu sloučenin.

Odkazy

1. Knox J, Ross P 1997. Advances in Chromatography. 37, 73-119.

2. Möckel HJ, Braedikow A, Melzer H, Aced G. 1991. A Comparison of the Retention of Homologous Series and Other Test Solutes on an Ods Column and a Hypercarb Carbon Column. Journal of Liquid Chromatography. 14(13):2477-2498. https://doi.org/10.1080/01483919108049334

3. Tanaka N, Tanigawa T, Kimata K, Hosoya K, Arai T. 1991. Selectivity of carbon packing materials in comparison with octadecylsilyl- and pyrenylethylsilylsilica gels in reversed- phase liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 54929-41. https://doi.org/10.1016/s0021-9673(00)91416-x

4. Lutsey PL, Eckfeldt JH, Ogagarue ER, Folsom AR, Michos ED, Gross M. 2015. The 25-hydroxyvitamin D3 C-3 epimer: Distribution, correlates, and reclassification of 25-hydroxyvitamin D status in the population-based Atherosclerosis Risk in Communities Study (ARIC). Clinica Chimica Acta. 44275-81. https://doi.org/10.1016/j.cca.2014.12.036

5. Karras S, Kotsa K, Angeloudi E, Zebekakis P, Naughton D. 2017. The Road Not So Travelled: Should Measurement of Vitamin D Epimers during Pregnancy Affect Our Clinical Decisions?. Nutrients. 9(2):90. https://doi.org/10.3390/nu9020090

6. Shah I, James R, Barker J, Petroczi A, Naughton DP. 2011. Misleading measures in Vitamin D analysis: A novel LC-MS/MS assay to account for epimers and isobars. Nutr J. 10(46): https://doi.org/10.1186/1475-2891-10-46