Tipy a triky pro HPLC - Příprava mobilní fáze
Dr. Egidijus Machtejevas, Lead Expert, Analytical Science Liaison
Článek z časopisu Analytix Reporter - číslo 10
Úvod
Nejdůležitější součástí chromatografické sestavy je kolona. Ale i když zajišťuje retenci, výsledná separace také silně závisí na mobilní fázi (MP). Různé účinky, které mobilní fáze nabízí, ovlivňují retenci a diferenciální migraci (selektivitu) rozpuštěných látek přes kolonu. Během vývoje a optimalizace metody proto může být nutné separaci vyladit změnou parametrů mobilní fáze, jako je typ rozpouštědla, přísady (různé pufry, činidla pro iontové páry) nebo provozní podmínky (doba/strmost gradientu, teplota, průtok).
Často problémy s chromatografickou separací souvisejí s nesprávně/nedůsledně připravenou mobilní fází. Proto lze pozorovat příklon k používání jednodušších mobilních fází z praktických důvodů větší robustnosti metody, snadnějšího přenosu metody a snadného použití (např. v klinické diagnostice nebo při řízení procesů).
Čistota přísad rozpouštědla/mobilní fáze
Většina z vás zná pravidlo: "odpadky dovnitř, odpadky ven." Toto přísloví platí zejména při výběru správné čistoty složek mobilní fáze. Například je naprostou nutností používat rozpouštědla & činidla gradientové kvality pro gradientové separace, abyste získali přesnou, reprodukovatelnou a čistou základní linii (bez duchů píků) a citlivou chromatografickou separaci (viz také Tipy a triky pro HPLC v Analytix Reporter 9 "Zvyšte citlivost své metody HPLC/UHPLC"). Použití správné a vhodné třídy rozpouštědel podle aplikace (např. hypergrade pro LC-MS pro metody LC-MS, více na SigmaAldrich.com/Solvents) také minimalizuje pravděpodobnost kontaminace a prodlužuje životnost chromatografické kolony.
V případech vyžadujících přidání jakéhokoli činidla, jako je pufr, je třeba zajistit, aby činidlo splňovalo požadovanou kvalitu a nemělo prošlou dobu použitelnosti. Degradační látky z prošlých aditiv vedou k duchovitým píkům v chromatogramech vzorků. Některá aditiva degradují rychleji v závislosti na své povaze (například 20 mM, pH 7 fosfátový pufr). Nesprávná/neopatrná manipulace (například zbytky rozpouštědla vložené zpět do láhve, láhev ponechaná na laboratorním stole bez uzavřeného uzávěru, ztracené hroty pipet plovoucí uvnitř láhve a podobně) těchto činidel rychle kazí chemikálie.
Míchání mobilních fází
U izokratických separací s předem smíchanými mobilními fázemi je třeba při jejich přípravě zohlednit objemové kontrakce rozpouštědel v běžně používaných směsích (voda/acetonitril, metanol nebo tetrahydrofuran). Jediným správným způsobem přípravy takových směsí mobilních fází je odděleně odebrat přesně odměřené objemy složek a smíchat je. Například pro získání 70% organické mobilní fáze je třeba odděleně přesně odměřit 300 ml vody a 700 ml organického rozpouštědla a poté je v baňce smíchat dohromady. Pokud se však přesně odměří pouze voda a poté se přidá organické rozpouštědlo, aby se vytvořil požadovaný konečný objem, bude v důsledku smršťování směsi rozpouštědel výsledná síla rozpouštědla o něco vyšší (nebo slabší v případě, že se nejprve přidalo organické rozpouštědlo a voda se přidala později). Při předběžném míchání MP je třeba věnovat pozornost toxickým výparům rozpouštědel, které by mohly být uvolňovány, a to pod digestoří.
V současné době jsou gradienty obecně správně formulovány pomocí gradientových čerpadel; při porovnávání přístrojů s nízkotlakými a vysokotlakými gradientovými systémy však mohou být pozorovány určité drobné rozdíly v retenčním chování v důsledku jejich mechanismů míchání.
Osobně v chromatografii s obrácenou fází dávám přednost metodám HPLC s předem smíchanými mobilními fázemi, jako je 5 % acetonitril ve vodě a/nebo 5 % vody v acetonitrilu. Důvodem takové preference je zvýšení účinnosti odplynění, zamezení zahřívání směsi (např. methanol ve vodě) nebo ochlazování (např. acetonitril ve vodě) při míchání a také zlepšení účinnosti míchání tím, že obě mobilní fáze mají podobnější viskozitu a povrchové napětí. Omezení těchto předem smíchaných rozpouštědel spočívají v tom, že síla rozpouštědla mobilní fáze B nemůže být 100% a v dalším kroku přípravy mobilní fáze - což je další, potenciální zdroj chyb. Obvykle se doporučuje používat rozpouštědla mobilních fází přímo z jejich dodacích obalů, aby se zabránilo další možnosti kontaminace.
Závěrečným krokem přípravy mobilní fáze je filtrace. Existuje mnoho různých typů filtrů, které lze zvolit podle filtrovaných rozpouštědel. Doporučují se membránové filtry s velikostí pórů nejméně 0,45 µm pro systémy HPLC a 0,22 µm pro systémy UHPLC. Filtrace odstraňuje částice z připravené mobilní fáze a zabraňuje ucpávání systému a kolony.
Více informací o přípravě mobilní fáze najdete v HPLC Tips &; Tricks:
Další články o HPLC tipech &; tricích
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?