Imunoprecipitace fúzních proteinů FLAG pomocí afinitních gelů s monoklonálními protilátkami

• Co je peptidová značka FLAG a jak se používá k izolaci a čištění proteinů?
• Technický přehled imunoprecipitace
• Protokol pro imunoprecipitaci (IP) fúzních proteinů FLAG pomocí afinitních gelů M2
• Purifikace malých množství fúzních proteinů FLAG

Imnoprecipitaci (IP) lze použít pro účinnou izolaci a purifikaci proteinů fúzovaných s peptidovou značkou FLAG^® s vysokou výtěžností. IP se provádí pomocí afinitního gelu ANTI-FLAG^® M2, což je vysoce specifická monoklonální protilátka kovalentně vázaná na agarosovou pryskyřici. Afinitní pryskyřice umožňuje účinnou vazbu proteinů značených FLAG^® bez nutnosti předběžných kroků a kalibrací. Imunoprecipitované fúzní proteiny značené FLAG^® lze účinně eluovat z pryskyřice pomocí kyselých podmínek nebo konkurencí s peptidem FLAG^®. Imunoprecipitované proteiny lze poté analyzovat z hlediska jejich velikosti, posttranslačních modifikací a gelových interakcí během elektroforézy a také pomocí testů aktivity .

Co je peptidová značka FLAG a jak se používá k izolaci a čištění proteinů?

PeptidyFLAG^® jsou značkovací peptidy používané při detekci a purifikaci proteinů. Značkovací peptid FLAG^® se skládá z osmi aminokyselin (DYKDDDDK), které maximalizují imunogenicitu, takže vysokoafinitní monoklonální protilátky zvýšené proti peptidu FLAG® mohou být použity jako značkovací peptid.sup>® sekvenci lze použít k detekci a izolaci proteinů obsahujících peptid FLAG^®. Pomocí rekombinantní techniky lze přidat značkovací peptidy FLAG^® na N-konec proteinu, na C-konec nebo na N-konec, kterému předchází methioninový zbytek (Met-FLAG^®), a do vnitřních pozic<...>.br />

Technický přehled imunoprecipitace

Imunoprecipitace se skládá z následujících kroků a meziproduktů: Imunoprecipitace zahrnuje: lýzu buněk, vazbu specifického antigenu na protilátku, komplex protilátka-antigen, precipitaci, promytí precipitátu a disociaci antigenu z imunokomplexu.

Protokol pro imunoprecipitaci (IP) fúzních proteinů FLAG pomocí afinitních gelů M2, které obsahují monoklonální protilátku M2 kovalentně vázanou na zesíťované 4% agarózové kuličky

Použijte afinitní gel EZ view red anti-FLAG M2 F2426, nebo afinitní gel Anti-FLAG M2 A2220.

Purifikace malých množství fúzních proteinů FLAG

Poznámka: Pro postup imunoprecipitace se doporučují dvě kontrolní reakce

• Pozitivní kontrola (fúzní protein FLAG-BAP, stejně jako amino-terminální koncový protein FLAG-BAP, který se používá k imunoprecipitaci).nbsp;P7582, karboxy-terminální P7457 nebo fúzní protein Met-FLAG-BAP P5975)
• Negativní kontrola (slepé činidlo s NEproteinem)

a) Pečlivě promíchejte afinitní gelové kuličky, dokud nebudou zcela suspendovány. Okamžitě alikvotujte 40 µl 50% suspenze (20 µl objemu zabaleného gelu) do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky pomocí pipetovací špičky se širokým otvorem nebo odřízněte 1 mm z konce běžné pipetovací špičky.

b) Omyjte/equilibraci kuliček: Přidejte 500 µl TBS (50 mM Tris HCL, 150 mM NaCl, pH 7,4), vortexujte a odstřeďujte 30 - 60 sekund při 5000-8200 x g. Odstraňte supernatant a dávejte pozor, abyste nenarušili kuličky.

c) Propláchněte opět výše uvedeným způsobem a zkumavku postavte na led, dokud nebude vzorek připraven k přidání.  Poznámka: Při současném zpracování více imunoprecipitačních vzorků lze kombinované množství potřebné pryskyřice propláchnout dohromady. Každé promývání by mělo být provedeno pomocí TBS v objemu nejméně 20násobku celkového objemu baleného gelu. Po promytí lze pryskyřici alikvotovat pro požadovaný počet vzorků.

d) Příprava vzorků:

• Celulární lyzát odstředěním (14 000 x g po dobu 10-15 min při 2-4 °C)
• Vypočítejte potřebné množství lyzátu. Objem bude záviset na úrovni exprese fúzního proteinu FLAG v transfekovaných buňkách.

e) Vazba: Přidejte 200-1000 µl buněčného lyzátu (v případě potřeby upravte konečný objem na 1 ml přidáním lyzačního pufru [50 mM Tris HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100]). Poznámka: objem lyzátu bude záviset na úrovni exprese fúzního proteinu FLAG v transfekovaných buňkách. Pro pozitivní kontrolu přidejte 1 ml TBS a 4 µl 50 ng/µl fúzního proteinu FLAG-BAP (přibližně 200 ng). Pro negativní kontrolu přidejte pouze 1 ml lyzačního pufru. Inkubujte všechny vzorky a kontroly třepáním pomocí válečkové třepačky nebo třepačky s převráceným koncem po dobu přibližně 1-2 hodin při teplotě 2-8 °C (vazebný krok lze prodloužit přes noc, aby se zajistila maximální vazba).

f) Odstřeďujte zkumavku po dobu 30 s-1 min při 5000-8200 x g a odsajte supernatant (průtok). V případě potřeby lze průtok ponechat.

g) Propláchněte kuličky: Přidejte 500 µl TBS, vortexujte a odstřeďujte 30 s-1 min při 5000- 8200 x g. Odstraňte supernatant

h) Promývání opakujte ještě dvakrát.

i) Eluce vzorku: Lze provést tři metody eluce, přičemž volba bude záviset na vlastnostech značeného proteinu a také na následné aplikaci.

1. Eluce fúzního proteinu FLAG lze dosáhnout za nativních podmínek konkurencí pomocí peptidu 3X FLAG (F4799). Tato eluce je nejúčinnější metodou.
2. Eluci lze provést za kyselých podmínek s použitím 0,1 M glycin HCl, pH 3,5. V případě, že je eluce provedena v kyselém prostředí, je nutné použít 0,1 M glycin HCl. Tato metoda eluce je rychlá a účinná, ale vyžaduje okamžitou neutralizaci vzorku.
3. Eluce lze dosáhnout elektroforézou za použití SDS-PAGE pufru pro vzorky. Při použití této metody nelze kuličky znovu použít, protože SDS denaturuje protilátku M2.

Eluce s peptidem 3X FLAG (F4799)

i. Příprava 3X peptidu FLAG:

• Rozpusťte 3X peptid FLAG v 0,5 M Tris HCL, pH 7. V případě, že se peptid FLAG nachází v 0,5 M Tris HCL, rozpusťte jej.5 1 M NaCl na konečnou koncentraci 25 µg/µl
• Zásobní roztok zřeďte 5krát pomocí diH₂0 na konečnou koncentraci 5 µg/µl
• Zásobní roztok zřeďte 5krát pomocí diHg/µL
• Připravte pracovní roztok Elution o koncentraci 150 ng/µL přidáním 3 µl zásobního roztoku o koncentraci 5 µg/µL do 100 µl TBS.

ii. Ke každému vzorku přidejte 100 μl 3X pracovního roztoku FLAG pro eluci a inkubujte 30 min při 2-8 °C za mírného protřepávání.

iii. Odstřeďujte 30 s-1 min při 5000-8200 x g. Přeneste supernatant do čerstvé zkumavky. Dávejte pozor, abyste nepřenesli žádnou pryskyřici.

1.  Eluce za kyselých podmínek (0,1 M glycin HCl pH -3,5) Postup se provádí při pokojové teplotě.

i. Ke každému vzorku přidejte 100 µl 0,1 M glycin HCl o pH 3,5
ii. Inkubujte 5-10 min za mírného protřepávání
iii. Odstřeďujte pryskyřici po dobu 30 s-1 min při 5000-8200 x g
iv. Neutralizujte vzorek přenesením supernatantu do čerstvých zkumavek obsahujících 10 µl 0,5 M Tris HCl, pH 7,4, s 1,5 M NaCl
v. Ihned použijte nebo dlouhodobě uchovávejte při -20 °C.

2. Eluce s SDS-PAGE vzorkovacím pufrem (62,5 M Tris HCl, pH 6,8 s 2 % SDS, 10 % (v/v) glycerolu a 0,5 M Tris HCl, pH 6,8) a 0,5 % (v/v) glycerolu.002% bromfenolovou modří. Postup se provádí při pokojové teplotě.

Poznámka: Aby se minimalizovala denaturace protilátky, nemělo by se přidávat žádné redukční činidlo (DTT nebo 2-merkaptoetanol). Přidání redukčních činidel způsobí disociaci těžkých a lehkých řetězců imobilizované protilátky M2 (pásy 25-50 kDa)

i. Ke každému vzorku přidejte 20 µl 2X vzorkovacího pufru
ii. Vzorky vařte po dobu 3 minut
iii. Odstřeďujte 30 s - 1 min při 5000-8200 x g
iv. Přeneste supernatant do čerstvé zkumavky. Vzorky jsou připraveny k načtení na SDS-PAGE.

 

Obrázek 1. Shrnutí možností používaných pro imunoprecipitaci v dávkovém režimu pro proteiny s nízkou abundancí