Purifikace nebo odstranění proteinů vážících DNA
Heparinová sefarosa, Heparinová sefarosa 6 Fast Flow, Capto Heparin
Bílkoviny vázající DNA tvoří extrémně rozmanitou třídu proteinů, které mají společnou jedinou vlastnost - schopnost vázat se na DNA. Funkčně lze tuto skupinu rozdělit na ty, které jsou zodpovědné za replikaci a orientaci DNA, jako jsou histony, nukleozomy a replikázy, a na ty, které se podílejí na transkripci, jako jsou RNA/DNA polymerázy, transkripční aktivátory a represory a restrikční enzymy. Mohou být vyráběny jako značené proteiny, aby umožnily specifičtější purifikaci, ale jejich schopnost vázat DNA umožňuje také skupinovou specifickou purifikaci pomocí heparinu jako ligandu. Heparin je vysoce sufo- novaný glykosaminoglykan se schopností vázat velmi širokou škálu biomolekul včetně:
- Bílkovin vážících DNA, jako jsou iniciační faktory, elongační faktory, restrikční endonukleázy, DNA ligázy, DNA a RNA polymerázy.
- Inhibitory serinových proteáz, jako je antitrombin III, proteázové nexiny.
- Enzymy, jako jsou proteázy žírných buněk, lipoproteinová lipáza, koagulační enzymy, superoxiddismutáza.
- Růstové faktory, jako je fibroblastový růstový faktor, růstový faktor Schwannových buněk, růstový faktor endoteliálních buněk.
- Proteiny extracelulární matrix, jako je fibronectin, vitronectin, laminin, trombospondin, kolageny.
- Hormonální receptory, jako jsou estrogenové a androgenní receptory.
- Lipoproteiny.
Struktura heparinu je znázorněna na obrázku 3.10. Heparin má dva způsoby interakce s proteiny a v obou případech může být interakce oslabena zvýšením iontové síly.
- V interakci s proteiny vážícími DNA heparin napodobuje polyaniontovou strukturu nukleové kyseliny.
- V interakci s koagulačními faktory, jako je antitrombin III, působí heparin jako affinitivní ligand.

Obrázek 3.10.Struktura heparinového polysacharidu sestávajícího ze střídajících se zbytků kyseliny hexuronové (A) a D-glukosaminu (B). Kyselina hexuronová může být buď kyselina D-glukuronová (nahoře), nebo její C-5 epimer, kyselina L-iduronová (dole). R1 = -H nebo -SO3-, R2 = -SO3- nebo -COCH3.
Charakteristiky chromatografických médií
Charakteristiky chromatografických médií pro purifikaci nebo odstranění proteinů vážících DNA jsou uvedeny v tabulce 3.11.
1 Krátkodobé se vztahuje na interval pH pro regeneraci, čištění na místě a sanitační postupy. Dlouhodobým se rozumí interval pH, při kterém je médium dlouhodobě stabilní bez nepříznivých účinků na jeho následnou chromatografickou výkonnost.
Varianty purifikace
Varianty purifikace pro chromatografické médium Heparin Sepharose 6 Fast Flow a předbalené kolony a Capto Heparin jsou uvedeny v tabulce 3.12.
1 Viz Příloha 4 k převodu rychlosti proudění (cm/h) na objemovou rychlost proudění (ml/min). Maximální provozní flow se vypočítá z měření v zaplněné koloně s výškou lože 10 cm a i.d. 5 cm.
2 Kolona o průměru 1 m, výška lože 20 cm.
Příklady purifikace
Obrázky 3.11 až 3.13 ukazují příklady podmínek použitých pro purifikaci různých proteinů vážících DNA.

Obrázek 3.11.Částečná purifikace rekombinantní HIV-reverzní transkriptázy na Hi Trap Heparin HP

Obrázek 3.12.Částečná purifikace rekombinantního proteinu Oct-1 vázajícího DNA (s laskavým svolením Dr. Gunnara Westina, Univerzitní nemocnice, Uppsala, Švédsko) pomocí HiTrap® Heparin HP, 5 ml.

Obrázek 3.13.purifikace scCro8 na HiPrep Heparin FF 16/10.
Provádění separace
Heparinová separaóza 6 Fast Flow, Heparinová separaóza High Performance
- Kolona se ekvilibruje 10 CV vazebného pufru.
- Přiloží se vzorek.
- Propláchne se 5 až 10 CV vazebného pufru nebo dokud se v eluentu neobjeví žádný materiál (sledováno UV absorpcí při A280 nm).
- Eluujte 5 až 10 CV elučního pufru pomocí kontinuálního nebo stupňovitého gradientu od 0 % do 100 % elučního pufru.
Modifikujte selektivitu heparinu změnou pH nebo iontové síly pufrů. Eluujte pomocí kontinuálního nebo krokového gradientu s NaCl, KCl nebo (NH4)2SO4 až do 2 M.
Při použití k purifikaci nebo odstranění koagulačních faktorů:
Protože heparin působí jako afunkční ligand pro koagulační faktory, doporučuje se do vazebného pufru zahrnout minimální koncentraci 150 mM NaCl.
Pokud zvyšující se gradient soli poskytuje neuspokojivé výsledky, použijte jako konkurenční činidlo v elučním pufru heparin (1 až 5 mg/ml).
Čištění
Ionizovaně navázané proteiny odstraníte promytím s 0,5 mg/ml.5 CV 2 M NaCl po dobu 10 až 15 min.
Odstraňte vysrážené nebo denaturované proteiny promytím 4 CV 100 mM NaOH po dobu 1 až 2 h; nebo 2 CV 6 M guanidin-hydrochloridu po dobu 30 až 60 min; nebo 2 CV 8 M močoviny po dobu 30 až 60 min. Hydrofobně vázané proteiny odstraníme promytím 4 CV 0,1 % až 0,5 % Tween 20 po dobu 1 až 2 h.
Chemická stabilita
100 mM NaOH (1 w při 20 °C), 50 mM octan sodný, pH 4,0, 4 M NaCl, 8 M močovina, 6 M guanidin-hydrochlorid.
Skladování
Chromatografická média a kolony promyjte 50 mM octanem sodným obsahujícím 20 % ethanol (pro balená média použijte přibližně 5 CV) a skladujte při teplotě 4 °C až 8 °C.
Capto Heparin
- Ekvilibrace s 5 CV vazebného pufru.
- Přiložte vzorek.
- Vymývací krok 1: promývání se 40 CV vazebného pufru.
- Vymývací krok 2: promývání s 15 CV promývacího pufru.
- Eluce s 9,5 CV elučního pufru.
Pro kolonu o objemu 1 ml se doporučuje rychlost flow 0,5 ml/min.
Čištění
Látky, jako jsou denaturované proteiny, které se během regenerace nevylučují, lze odstranit postupem čištění na místě (CIP). Doporučený postup CIP pro Capto Heparin je 4 CV 100 mM NaOH s dobou kontaktu 1 až 2 h.
Skladování
Nepoužitá chromatografická média skladujte při teplotě 4 ºC až 30 ºC ve 20% ethanolu a 50 mM octanu sodného.
Materiály
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?