Protokol o imunofluorescenci na Yaleově univerzitě

Postup pro fixaci, imunobarvení a zobrazování v 384jamkových destičkách

Stáhněte si protokol (PDF)
Přejděte na webovou stránku testovaných imunofluorescenčních protilátek 

Reagencie
Bezpečnostní opatření a vyloučení odpovědnosti
Pokyny k přípravě
Postup
Výsledky

Reagents

• 384jamkové zobrazovací destičky (Aurora)
• Podrobné informace o přípravku.HUVEC (sdružené, Lonza)
• EBM-2 médium (Lonza)
• Fixační roztok - 16% vodný roztok paraformaldehydu (PFA) (zředěný na 4% v jamkách)
• 1x PBS bez Ca2+ a Mg2+  (připravený z prášku)
• Donorské telecí sérum (DCS)
• Triton^® X-100
• Primární protilátka
  
• Sekundární protilátka (Alexafluor 647 kozí anti-králičí IgG-vysoce křížově adsorbovaná)
• Hoechst 33342

Upozornění a prohlášení o vyloučení odpovědnosti

Informace týkající se nebezpečnosti a bezpečného zacházení naleznete v bezpečnostním listu.

Pokyny pro přípravu

Zásobní roztok Tritonu X-100 - 10% (v/v) roztok v PBS

Roztok protilátky - 10% DCS v PBS

Zásobní roztok Hoechst 33342 - 10 mg/ml v PBS

Roztok pro permeabilizaci a blokování - 0.2% Triton X-100 a 10% dárcovské telecí sérum v PBS

Roztoky primárních protilátek - připravte 8 různých ředění primárních protilátek v rozmezí od 1:50 do 1:6400 pomocí ředidla protilátek.

Roztok sekundárních protilátek - sekundární protilátku nařeďte v poměru 1:1000 pomocí ředidla protilátek. Přidejte základní roztok Hoechst 33342 na konečnou koncentraci 1 mg/ml (10 000násobné ředění základního roztoku).

Postup

1. Příprava buněk - buňky HUVEC byly kultivovány v médiu EBM-2 a rozmístěny na 384jamkové destičky v hustotě 3 500 buněk na jamku. Destičky byly poté inkubovány po dobu 24-48 hodin, dokud nedošlo k 80-90% konfluenci před fixací.
2. Fixace
   1. Fixační roztok (16% PFA) byl v testovacích jamkách zředěn 4krát (17 ml fixačního roztoku přidáno k 50 ml média v jamkách).
      Poznámka:
   2. Fixační roztok lze také naředit na 4% PFA s PBS a přidat přímo do jamek po odsátí média.
   3. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě.
   4. Jednou propláchněte 1x PBS.
   5. Skladujte destičky při teplotě 4 °C, dokud nebudou připraveny k barvení.
3. Imnobarevné barvení
   1. Jednou propláchněte 1x PBS a odsajte.
   2. Přidejte 50 ml permeabilizačního a blokovacího roztoku do každé jamky.
   3. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě.
   4. Aspirujte permeabilizační a blokovací roztok a přidejte 25 ml roztoku primární protilátky.
   5. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě.
      Poznámka: V některých případech lze dobu inkubace primární protilátky prodloužit, aby se zvýšila intenzita signálu.
   6. Aspirujte roztok primární protilátky, jednou promyjte v 1x PBS a odsajte.
   7. Přidejte 25 ml roztoku sekundární protilátky.
   8. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě.
   9. Čtyřikrát promyjte 1x PBS.
   10. Uchovejte destičky v 50 ml 1x PBS při 4 °C, dokud nebudou připraveny k zobrazení.

Výsledky

Zobrazení
Všechny snímky byly získány pomocí vysoce výkonné konfokální zobrazovací jednotky PerkinElmer^® Opera^® . Všechny protilátky byly zobrazeny v 8 různých ředěních v rozmezí od 1:50 do 1:6400, přičemž byly pořízeny 2-3 snímky na jamku. Destičky byly zobrazovány při 20´ (pro sběr dat) a 40´ (pro generování vysoce kvalitních snímků). Signál protilátky byl měřen pomocí 640 nm (červeného) laseru a intenzita Hoechstu byla měřena pomocí 405 nm (fialového) laseru. V obou případech byly expozice pořízeny pro každý kanál zvlášť, aby se omezilo prosakování fluorescence mezi kanály. Doby expozice se pro každý kanál lišily s maximem 2 000 ms pro kanál 640 nm a 400 ms pro kanál 405 nm.

Sběr dat
Data byla generována pomocí softwarového balíčku PerkinElmer Acapella^® . Hodnoty intenzity byly získány pomocí algoritmu NFkB Translocation. Jaderná intenzita byla vypočtena ze signálu protilátky v oblasti překryté barvením Hoechst. Cytoplazmatická intenzita byla vypočtena z oblasti cytoplazmatického prstence definované oblastí mimo jadernou oblast. Všechny hodnoty představují průměrnou intenzitu na buňku v každém poli.

Triton je registrovaná ochranná známka společnosti Dow Chemical Company.
PerkinElmer, Opera a Acapella jsou registrované ochranné známky společnosti PerkinElmer Inc.

Zaručujeme, že naše produkty odpovídají informacím obsaženým v této a dalších našich publikacích. Kupující musí určit vhodnost výrobku (výrobků) pro své konkrétní použití. Mohou se na něj vztahovat další podmínky. Viz zadní strana faktury nebo balicího listu.