Ekstrakcja DNA i amplifikacja WGA z próbek gleby

Genomowe DNA z próbek gleby może być łatwo uszkodzone przez nukleazy i zanieczyszczenia, co skutkuje niską wydajnością DNA. W rezultacie zdolność badacza do przeprowadzenia dalszej analizy może być zagrożona. Po wyizolowaniu DNA z próbki gleby należy postępować zgodnie z protokołem amplifikacji całego genomu GenomePlex™ 

Izolacja DNA

Do tej procedury zalecamy użycie zestawu UltraClean Soil Kit firmy MO Bio Laboratories Inc.

1. Dodaj 0,5 g próbki gleby do dostarczonej probówki z roztworem perełek o pojemności 2 ml.
2. Delikatnie worteksować w celu wymieszania.
3. Dodać 60 μL Roztworu 1 i kilkakrotnie odwrócić.
4. Dodać 200 μL roztworu IRS (roztwór do usuwania inhibitorów).
5. Worteksować z maksymalną prędkością przez 10 minut.
6. Wirować z prędkością 10 000 × × g  przez 30 sekund (NIE przekraczać 10 000 × × × g , ponieważ probówki mogą pęknąć).
7. Przenieś supernatant do czystej probówki mikrowirówki (supernatant może zawierać cząstki gleby).
8. Dodać 250 μL roztworu S2 i worteksować przez 5 sekund.
9. Inkubować w temperaturze 4°C przez 5 minut.
10. Odwirować probówki z prędkością 10 000 × g przez 1 minutę.
11. Przenieś 450 μL supernatantu do czystej probówki do mikrowirówki.
12. Dodać 900 μL roztworu S3 do supernatantu i worteksować przez 5 sekund.
13. Załadować 700 μL roztworu na filtr wirówkowy i wirować z prędkością 10 000 × g  przez 1 minutę.
14. Odrzucić przesącz i dodać pozostały supernatant do filtra wirówkowego i odwirować z prędkością 10 000 × g przez 1 minutę
15. Dodać 300 μL roztworu S4 i wirować przez 30 sekund z prędkością 10 000 × g. Odrzucić przepływ.
16. Wirować przez 1 minutę.
17. Ostrożnie umieść filtr wirówkowy w czystej probówce do mikrowirówki.
18. Dodać 50 μL roztworu S5 na membranę filtra.
19. Wirować przez 30 sekund i wyrzucić filtr wirówkowy.
20. Przechowywać wymyte DNA w temperaturze -20°C lub przejść do etapu amplifikacji.

Uwaga: W przypadku korzystania z WGA2 nie ma potrzeby dostarczania polimerazy DNA, ponieważ enzym jest dostarczany wraz z zestawem

Amplifikacja WGA

Protokół dla amplifikacji całego genomu GenomePlex™ wykonywanej przy użyciu GenomePlex™ Whole Genome Amplification Kit (WGA1) i/lub GenomePlex™ Complete Whole Genome Amplification Kit (WGA2).

Fragmentacja
Przygotować roztwór DNA o stężeniu 1 ng/ml z protokołu ekstrakcji krwi pełnej opisanego powyżej.

Dodaj 1 μL 10X buforu do fragmentacji do 10 mL DNA (1 ng/μL) w probówce PCR.

Umieść probówkę w termocyklerze w temperaturze 95 °C na dokładnie 4 minuty. Należy pamiętać, że inkubacja jest wrażliwa na czas i wszelkie odchylenia mogą zmienić wyniki.

Natychmiast schłodzić próbkę na lodzie i krótko odwirować.

Przygotowanie biblioteki
Dodać 2 μL 1x buforu do przygotowania biblioteki.

Dodać 1 μL roztworu stabilizującego bibliotekę.

Dokładnie wymieszać i umieścić w termocyklerze w temperaturze 95 °C na 2 minuty.

Schłodzić próbkę na lodzie i krótko odwirować.

Dodać 1 μL Library Preparation Enzyme, dokładnie wymieszać i krótko odwirować.

Umieścić próbkę w termocyklerze i inkubować w następujący sposób:

    16 °C przez 20 minut
    24 °C przez 20 minut
    37 °C przez 20 minut
    75 °C przez 5 minut
    4 °C hold
Wyjąć próbki z termocyklera i krótko odwirować. Próbki mogą być amplifikowane natychmiast lub przechowywane w temperaturze - 20 °C do trzech dni.

Amplifikacja
Dodaj następujące odczynniki do całej 15 μL reakcji przygotowanej w poprzednim kroku:

    7.5 μL 10x Amplification Master Mix
    47.5 μL wody wolnej od nukleazy
    5,0 μL JumpStart™ Taq DNA Polymerase (12.5 jednostek) dla WGA1
    -lub-
    5.0 μL polimerazy DNA WGA dla WGA2

Dokładnie wymieszać, krótko odwirować i rozpocząć termocykling:

    Denaturacja początkowa: 95 °C przez 3 minuty
    Wykonaj 14 cykli w następujący sposób:
    Denaturacja: 95 °C przez 15 sekund
    Anneal/Extend: 65 °C przez 5 minut

Po zakończeniu cyklu utrzymywać reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do analizy lub oczyszczania.

Reamplifikacja

1. Dodaj 10 μL amplifikowanego DNA WGA o stężeniu 1 ng/μL do probówki PCR lub płytki wielodołkowej.
Uwaga: Konieczne jest oczyszczenie reakcji WGA w celu zmniejszenia możliwego błędu w reamplifikacji. Zalecamy użycie zestawu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (numer produktu NA1020) lub standardowych metod oczyszczania, które izolują jedno- i dwuniciowe DNA.

2. Utwórz mieszaninę amplifikacyjną. Dla każdej reakcji reamplifikacji dodaj następujące składniki do DNA amplifikowanego przez WGA (krok 1):

    47.5 μL wody wolnej od nukleazy
    7,5 μL 10X Amplification Master Mix
    5 μL polimerazy DNA WGA

3. Dokładnie wymieszać, krótko odwirować i rozpocząć termocykling. Poniższy profil został zoptymalizowany dla termocyklera PE 9700 lub równoważnego:

    Denaturacja początkowa 95 °C przez 3 minuty
    Wykonać 14 cykli w następujący sposób:
    Denaturacja 94 °C przez 15 sekund
    Anneal/Extend 65 °C przez 5 minut

Po zakończeniu cyklu, utrzymywać reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do analizy lub oczyszczania. Stabilność DNA WGA jest równoważna genomowemu DNA przechowywanemu w tych samych warunkach.

Oczyszczanie

Oczyszczanie produktów amplifikacji wykonane przy użyciu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (NA1020)

1. Włóż kolumnę wiążącą GenElute™ Miniprep (z niebieskim O-ringiem) do dostarczonej probówki zbiorczej, jeśli nie została jeszcze zmontowana. Dodaj 0,5 ml roztworu przygotowującego kolumnę do każdej kolumny miniprep i odwiruj z prędkością 12 000 x g przez 30 sekund do 1 minuty. Wyrzucić eluat.
Uwaga: Roztwór przygotowujący kolumnę maksymalizuje wiązanie DNA z membraną, co skutkuje bardziej spójną wydajnością.

2. Dodaj 5 objętości Roztworu Wiążącego do 1 objętości reakcji PCR i wymieszaj. Na przykład, dodaj 500 ml Roztworu Wiążącego do 100 ml reakcji PCR.  Przenieś roztwór do kolumny wiążącej. Odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością (12 000 do 16 000 x g) przez 1 minutę. Odrzuć eluat, ale zachowaj probówkę zbiorczą.

3. Umieść ponownie kolumnę wiążącą w probówce zbiorczej. Nałożyć 0,5 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego na kolumnę i wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Wyrzucić eluat, ale zachować probówkę.
Uwaga: Przed pierwszym użyciem należy dodać etanol do koncentratu roztworu płuczącego. Patrz instrukcja przygotowania.

4. Umieść kolumnę w probówce zbierającej. Wirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 2 minuty, bez dodatkowego roztworu płuczącego, aby usunąć nadmiar etanolu. Wyrzucić pozostały eluat oraz probówkę zbierającą.

5. Przenieś kolumnę do nowej probówki o pojemności 2 ml. Nałożyć 50 μL roztworu elucyjnego lub wody na środek każdej kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
Uwaga: Podczas elucji wodą należy upewnić się, że pH wody wynosi od 5,5 do 8,5. Elucję można również przeprowadzić przy użyciu Roztworu do elucji rozcieńczonego 10-krotnie wodą.

6. Aby eluować DNA, odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Produkt amplifikacji PCR jest teraz obecny w eluacie i jest gotowy do natychmiastowego użycia lub przechowywania w temperaturze -20 °C.

Kwantyfikacja amplifikowanych produktów

Ilość DNA amplifikowanego przy użyciu zestawów GenomePlex™ Whole Genome Amplification można wykryć z lub bez oczyszczania. Aby uzyskać najwyższą jakość próbek DNA, zdecydowanie zaleca się oczyszczenie próbek po amplifikacji. Amplifikowane produkty mogą być mierzone za pomocą testu PicoGreen® dsDNA Quantitation Assay firmy Molecular Probes Inc. (#P-7589). Inną metodą wykrywania amplifikowanych produktów jest absorpcja spektrofotometryczna (OD260) na spektrofotometrze NanoDrop^® . Urządzenie to może mierzyć absorbancję na 1 μL próbki w szerokim zakresie dynamicznym, od 2-3700 ng/μL.

Dane aplikacyjne

Amplifikacja całego genomu przeprowadzona na próbce gleby

Produkty amplifikacji GenomePlex™ WGA rozdzielono na 1,5% żelu agarozowym. Do każdej studzienki załadowano 5 μL amplifikowanego produktu. Amplifikowane produkty GenomePlex mają średni rozmiar 400 bp. Wzór rozmazu jest specyficzny dla źródła, jak pokazano na żelu.

Ekstrakcja DNA z gleby
Pas 1-1 kb Ladder
Pas 2-Krew
Pas 3-Roślina
Pas 4-Wymaz z jamy ustnej
Pas 5-.Gleba
Lane 6-Kontrola pozytywna
Lane 7-1 kb Ladder

JumpStart i GenElute są znakami towarowymi firmy Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy i/lub jej podmiotów stowarzyszonych. Wszystkie inne znaki towarowe są własnością odpowiednich właścicieli. Szczegółowe informacje na temat znaków towarowych są dostępne za pośrednictwem publicznie dostępnych zasobów.