Fluorescenční zobrazování proteinů struktury cytoskeletu v živých buňkách pomocí lentivirových biosenzorů LentiBrite™

Úvod

Buněčná analýza dynamiky subcelulárních struktur prošla v posledních 15 letech revolucí díky vývoji a zdokonalení geneticky kódovaných fúzí mezi fluorescenčními proteiny (GFP/RFP) a buněčnými strukturními proteiny. Mikrotubuly jsou dynamická cytoskeletální vlákna složená z podjednotek tubulinu a aktinu, která hrají ústřední roli během mitózy (v mitotickém vřeténku) a během interfáze jako lešení pro řízený pohyb buněčného nákladu zprostředkovaný kinezinem a dyneinem. Několik rodin látek vázajících mikrotubuly, jako jsou taxany a vinka alkaloidy, narušuje dynamiku mikrotubulů a způsobuje buněčnou smrt a jsou klinicky účinnými chemoterapeutiky. Zobrazování dynamiky mikrotubulů v živých buňkách exprimujících tubulin značený fluorescenčními proteiny významně přispělo k našemu poznání látek vážících mikrotubuly.

Využili jsme lentivirové biosenzory LentiBrite™ k vizualizaci mikrotubulů (α-tubulin), aktinových mikrofilament (β-aktin), míst křížení mikrofilament (α-aktinin), intermediárních filament (vimentin) a fokálních adhezí (paxilin). Prokázali jsme, že tyto biosenzory, které jsou validovány pro použití s fluorescenční mikroskopií fixovaných a živých buněk, nenarušují zájmové struktury. Lokalizace proteinů značených GFP nebo RFP se shodovala s endogenními proteiny, jak bylo stanoveno imunocytochemií, a biosenzory vykazovaly charakteristické změny uspořádání po ošetření známými modulátory cytoskeletální struktury. Tento panel lentivirových biosenzorů tak poskytuje vhodnou metodu pro vizualizaci struktury a dynamiky cytoskeletu za různých fyziologických a patologických podmínek léčby, a to jak v endpointových modalitách, tak v modalitách zobrazování živých buněk v reálném čase.

Videozáznamy živých buněk LentiBrite™

Zobrazení autofagie v živých buňkách pomocí fluorescenčních biosenzorů LentiBrite™

Zobrazování β-aktinových proteinů cytoskeletu v živých buňkách pomocí fluorescenčních biosenzorů LentiBrite™

Zobrazení p62 v živých buňkách pomocí fluorescenčních biosenzorů LentiBrite™

Metody

Konstrukce lentivirových vektorů kódujících fúze fluorescenčních proteinů

Kódovací cDNA TagGFP2 a TagRFP byly získány od společnosti Evrogen. LentiBrite™ RFP- a GFP-α-tubulin byly zkonstruovány klonováním sekvence cDNA lidské tubuliny α-1B v plné délce na C-konec cDNA fluorescenčního proteinu. LentiBrite™ RFP- a GFP-β- aktin byly vytvořeny klonováním sekvence cDNA lidského β-aktinu v plné délce na C-konec cDNA fluorescenčního proteinu. LentiBrite™ GFP- a RFP vimentin byly vytvořeny klonováním sekvence cDNA lidského vimentinu v plné délce na C-konec cDNA fluorescenčního proteinu. LentiBrite™ α-actinin-GFP a -RFP byly vytvořeny klonováním sekvence cDNA lidské izoformy α-actinin-1 b v plné délce na N-konci cDNA fluorescenčního proteinu. LentiBrite™ paxillin-GFP a -RFP byly vytvořeny klonováním sekvence cDNA lidské paxilliny v plné délce na N-konci cDNA fluorescenčního proteinu.  Konstrukty byly přeneseny do pCDH-EF1-MCS, lentivirového vektoru obsahujícího konstitutivní, mírně exprimující promotor EF1α. Pseudotypizované lentivirové částice VSV-G 3. generace založené na HIV byly vytvořeny pomocí balíčkovacího systému lentivektoru pPACKH1.

Vysazení buněk a transdukce lentiviru

Buňky v růstovém médiu byly vysazeny na 8jamková skleněná komůrková sklíčka pro zobrazování fixovaných a živých buněk. Hustota výsevu byla zvolena tak, aby po noční kultivaci byla zajištěna 50-70% konfluence (např. 20 000-40 000 buněk/cm²). Druhý den po výsevu bylo médium nahrazeno čerstvým růstovým médiem. Vysoko titrovaná zásoba lentiviru byla zředěna v poměru 1:40 s růstovým médiem a k nasazeným buňkám byly přidány příslušné objemy lentiviru, aby bylo dosaženo požadované multiplicity infekce (MOI). MOI znamená poměr počtu infekčních lentivirových částic k počtu infikovaných buněk. Typické hodnoty MOI se pohybovaly od 10 do 40. Infikované buňky byly poté inkubovány při 37 °C, 5 % CO2 po dobu 24 hodin. 24 hodin po transdukci lentivirem bylo médium obsahující lentivirus odstraněno a nahrazeno čerstvým růstovým médiem. Buňky byly kultivovány dalších 24-48 h, přičemž médium bylo měněno každých 24 h. Při pokusech s inhibitory byly buňky inkubovány s příslušným inhibitorem v koncentraci a po dobu uvedenou v legendě.

Zobrazení živých buněk a barvení protilátkami

Pro zobrazování živých buněk bylo růstové médium nahrazeno Dulbeccovým modifikovaným médiem Eagle (DMEM) obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (FBS) a 25 mM HEPES. Komorové krycí sklo bylo umístěno do teplotně řízené vložky mikroskopového stolku na invertovaném širokoúhlém fluorescenčním mikroskopu Leica DMI6000B s objektivem s 63násobnou olejovou imerzní clonou a osvětlením/filtry vhodnými pro vizualizaci GFP nebo RFP. Zobrazování bylo zahájeno co nejrychleji po přidání modulátorů.

Pro koncové zobrazování byly buňky v komůrkových sklíčkách fixovány po dobu 30 minut při pokojové teplotě 3,7% formaldehydem v Dulbeccově fosfátovém roztoku (DPBS). Během fixace a ve všech následujících krocích byly buňky chráněny před světlem, aby se minimalizovalo jejich fotoblednutí. Vzorky byly poté dvakrát opláchnuty fluorescenčním barvicím pufrem (DPBS s 2% blokačním sérem a 0,25% Triton^® X-100). Primární protilátka ve fluorescenčním barvicím pufru byla přidána do každé jamky a inkubována 1 h při pokojové teplotě. Vzorky byly poté třikrát opláchnuty fluorescenčním barvicím pufrem před inkubací 1 h při pokojové teplotě s fluorescenční sekundární protilátkou a DAPI (1 μg/ml) v barvicím pufru. Nakonec byly vzorky dvakrát opláchnuty fluorescenčním barvicím pufrem a DPBS a sklíčka byla pokryta montážním médiem obsahujícím činidlo proti vyblednutí a krycími skly.

Výsledky

Zvýšená účinnost exprese biosenzoru pomocí transdukce lentiviry

Zkonstruovali jsme panel lentivirových částic obsahujících geneticky kódované fluorescenční markery pro cytoskeletální elementy. Použitím těchto lentivirových biosenzorů se výrazně zlepšila účinnost transfekce i homogenita ve srovnání s chemickou transfekcí pomocí plazmidové DNA (obrázek 1).

Obrázek 1. Transfekce plazmidy vs. transfekce lentivirem u snadno a obtížně transfekovatelných typů buněk. Buňky HeLa a HUVEC byly transfekovány konstruktem kódujícím TagGFP2-tubulin buď pomocí plazmidové DNA ve spojení s chemickým transfekčním činidlem na bázi lipidů, nebo pomocí lentivirových částic LentiBrite™. Obrázky byly získány pomocí fluorescenčního zobrazování v širokém poli s 20násobným objektivem (modrá = jaderný protibarvivový materiál DAPI, zelená = GFP-tubulin). Výsledkem transdukce lentivirem byla vyšší účinnost transfekce (zejména u HUVEC, u kterého byla transfekce plazmidem neúspěšná) a signál GFP-tubulinu s rovnoměrnější intenzitou fluorescence.

Panel lentivirových virů kódujících biosenzory živých buněk pro cytoskeletální elementy

Obrázek 2. LentiBrite™ lentivirové biosenzory se lokalizují na specifické cytoskeletální elementy. (A) GFP-paxilin zvýrazňuje fokální adheze v buňkách REF-52. (B) α-aktinin-RFP v buňkách REF-52 vykazuje pruhovaný filamentární vzor odpovídající místům křížení aktinových mikrofilament. (C) β-aktin-RFP v buňkách REF-52 vykazuje podobný vláknitý vzor jako α-aktinin, ale se vzorem spojité intenzity. (D) RFP-α-tubulin v HUVEC vykazuje vzor mikrotubulárních vláken vyzařujících z centra organizujícího mikrotubuly (bílá šipka). (E) GFP-vimentin v lidských MSC zvýrazňuje intermediární filamenta.

Specifičnost a lokalizace lentivirově podávaných biosenzorů

Protože geneticky kódované biosenzory mohou být náchylné k nesprávné lokalizaci, a to buď v důsledku sklonu konkrétního fluorescenčního proteinu k agregaci, nebo v důsledku nadměrné exprese biosenzoru, který přesytí zájmovou strukturu, snažili jsme se potvrdit specifičnost lokalizace lentivirálně dodaných biosenzorů. Zjistili jsme, že lentivirální dodávka cytoskeletálních markerů značených fluorescenčním proteinem umožňuje přesnou detekci příslušných cytoskeletálních elementů, jak bylo zjištěno 1) redistribucí biosenzoru po ošetření buněk specifickými inhibitory cytoskeletální struktury, 2) podobnou distribucí biosenzoru jako endogenního proteinu, jak bylo zjištěno pomocí imunofluorescence, a 3) zobrazením dynamiky cytoskeletu v živých buňkách.

Obrázek 3. Lokalizace tubulinu značeného RFP po ošetření modulátorem. HUVEC byly lentivirově transdukovány biosenzory s RFP-tubulinem při MOI 40. Transdukované buňky byly po dobu 4 h podrobeny následujícímu ošetření: (A) bez ošetření, (B) ošetřené 1 μM paklitaxelem nebo (C) ošetřené 25 μM nocodazolem. Buňky byly fixovány, upevněny a zobrazeny pomocí fluorescenčního mikroskopu s širokým polem. Buňky ošetřené paklitaxelem vykazovaly svazky mikrotubulů, které se stáčely kolem jádra, zatímco buňky ošetřené nocodazolem neobsahovaly žádné zjevné mikrotubulární struktury.

Obrázek 4. Exprese fluorescenčního proteinu a kolokace s barvením fluorescenčními protilátkami. Buňky HeLa byly transdukovány biosenzory TagRFP-vimentin s MOI 20 a o 72 hodin později byly buď ponechány bez ošetření, nebo ošetřeny 25 μM nocodazolu. Buňky byly následně fixovány, imunobarveny protilátkou proti vimentinu a zobrazeny pomocí širokoúhlého mikroskopu. Neošetřené buňky vykazovaly vláknitou síť vimentinu, na rozdíl od shlukovitého perinukleárního rozložení u buněk ošetřených nocodazolem. V obou případech se fluorescenčně značený protein (horní a prostřední řádek) kolokalizoval s barvením získaným pomocí protilátky proti vimentinu (spodní řádek).

Obrázek 5. Časosběrné zobrazování β-aktinu v živých buňkách transdukovaných lentivirem. Buňky REF-52 byly lentivirově transdukovány biosenzory TagRFP-β-actin a zobrazeny pomocí mikroskopie s širokým polem v reálném čase. Buňkám byla podána dávka 2 μM cytochalasinu D a okamžitě bylo zahájeno zobrazování, přičemž snímky byly pořizovány každých 30 s po dobu 30 min. Snímky ze statických snímků prokázaly přechod jemné vláknité organizace ke granulárnímu vzoru v blízkosti jádra a difuzní distribuci na buněčné periferii.

Závěr

Lentivirální biosenzory umožňují pohodlnou transdukci snadno a obtížně transfekovatelných typů buněk pomocí subcelulárních markerů značených fluorescenčním proteinem. Tyto předbalené lentivirové částice LentiBrite™ umožňují vyšší účinnost a homogennější expresi vnášených proteinů ve srovnání s nevirovými transfekčními metodami. Prokázali jsme použití cytoskeletálních markerů značených GFP nebo RFP v mikroskopii fixovaných i živých buněk. Kódované proteiny vykazovaly kolokaci s barvením protilátkami a příslušnou redistribuci po ošetření známými modulátory cytoskeletální struktury. Biosenzory LentiBrite™ představují řešení připravené k použití pro výzkumné pracovníky, kteří chtějí fluorescenčně vizualizovat přítomnost, nepřítomnost nebo pohyb proteinu za normálního, abnormálního, nemocného nebo indukovaného buněčného stavu.