Protokoly pro připojení kolagenu, rozpustnost a stabilita
Kolagen pro buněčné kultury
Kolagen je nejrozšířenějším proteinem savců a je hlavní složkou pojivových tkání a extracelulární matrix (ECM). Ve dvourozměrných a trojrozměrných buněčných kulturách vědci často používají kolagenový protein k pokrytí kultivačních misek.
Typicky je kolagen nejprve syntetizován jako jednotlivá monomerní vlákna předkolagenu bohatá na glycin z ribozomů v drsném endoplazmatickém retikulu (RER). Po transportu do lumen RER se signální peptidy štěpí za vzniku prokolagenu. Lysin a prolin jsou v lumen hydroxylovány a glykosylovány a vzniká šroubovice složená ze tří peptidů. Ta je poté transportována do Golgiho a vyloučena z buňky exocytózou. Propetidy prokolagenu jsou poté odstraněny a vzniká tropokolagen, který se může spojovat a vytvářet fibrily. Označení "typ kolagenu" podle Bornsteina a Trauba je dáno složením peptidů trojité šroubovice.
Kollagen se vyskytuje v podobě několika typů bílkovin, z nichž nejběžnější je typ I. V případě kolagenu typu I se jedná o typ I, který se vyskytuje ve formě bílkovin. kolagen typu I se nachází v kostech, šlachách, vazivu, cévách, meziobratlových ploténkách a Typ III, druhý nejhojnější typ kolagenu, se často společně s typem I nachází v kůži a cévách. kolagen typu II je hlavní proteinovou složkou chrupavky, typ IV. je primární proteinovou složkou bazální lamely a Typ V je spojen s organizací kolagenních vláken a inhibicí epiteliálního buněčného cyklu.
Důležité body, které je třeba mít na paměti před zahájením
- Ujistěte se, že buňky jsou zdravé a v dostatečném počtu.
- Roztoky kolagenu lze sterilizovat dialýzou v 0,25% roztoku kyseliny octové a 0,5% roztoku chloroformu.
- Nedoporučujeme sterilizovat roztok kolagenu membránovou filtrací. Při této metodě jsme zjistili značné ztráty bílkovin.
- Potahování plastových misek pro tkáňové kultury lze provádět sušením na vzduchu. Vysušené potažené misky lze sterilizovat vystavením UV světlu ve sterilní kultivační digestoři nebo opláchnutím 70% etanolem.
- Koncentrace povrchového pokrytí se může lišit v závislosti na kultivovaných buňkách. Pro každou buněčnou linii a aplikaci je třeba stanovit optimální podmínky pro přichycení.
- Kultivační desky/pokrývací sklíčka po nanesení povlaku příliš nevysušujte, protože to ovlivňuje přichycení buněk.
- Všechny kroky v protokolech je třeba provádět za sterilních podmínek.
Protokol o potahování kultivačních nádob kolagenem typu I
- Přidejte kolagen do kyseliny octové, abyste získali 0,1% (w/v) roztok kolagenu. Míchejte při pokojové teplotě po dobu 1-3 hodin, dokud se nerozpustí. Roztok kolagenu je třeba naředit 10krát, abyste získali pracovní koncentraci 0,01 %.
- Doporučujeme přenést roztok kolagenu do skleněné láhve se šroubovacím uzávěrem a na dno opatrně navrstvit chloroform. Množství chloroformu, které použijete, by mělo být přibližně 10 % objemu kolagenového roztoku. NETŘEPEJTE ANI NEMÍCHEJTE. Nechte stát přes noc v chladu. Asepticky odstraňte vrchní vrstvu obsahující váš kolagenový roztok.
- Nahrňte misky a nechte protein vázat několik hodin při pokojové teplotě, 37 °C nebo přes noc při 2-8 °C.
- Odstraňte přebytečnou tekutinu z potaženého povrchu a nechte jej přes noc zaschnout.
- Pokud roztok kolagenu není sterilní, lze vysušený potažený povrch sterilizovat nočním vystavením UV záření ve sterilním kukátku pro tkáňové kultury.
- Před zavedením buněk a média je opláchněte sterilní vodou pro tkáňové kultury nebo vyváženým roztokem soli.
Obrázek 1. Struktura proteinu kolagenu typu I.
Protokol potahování kolagenu typu II a IV pro kultivační nádoby
- Kolagen typu II a IV lze rekonstituovat na koncentraci 0,5-2,0 mg/ml v kyselině octové. Rozpouštějte několik hodin při teplotě 2-8 °C za občasného víření.
- Plastové misky na tkáňové kultury potahujte sušením na vzduchu. Alternativně můžete potažené nádoby na kultivaci předinkubovat přes noc při 2-8 °C (nebo několik hodin při 37 °C).
- Potažené misky lze sterilizovat vystavením UV světlu ve sterilní kultivační digestoři nebo opláchnutím 70% ethanolem.
Obrázek 2.A. Struktura bílkoviny kolagenu typu II, převážně tři vlákna. B. Struktura bílkoviny kolagenu typu IV, převážně dvě vlákna. C. Proteinová struktura kolagenu typu IV, převážně jedno vlákno.
Kolagen typu IV
Další kolageny: Typ II, typ III, typ I a III, typ I a IV a typ V.
Proč se v kolagenovém roztoku objevují nerozpustné částice?
Specifikace rozpustnosti pro některé kolagenové produkty, jako je C7661, je čirý až mlhavý bezbarvý roztok s několika nerozpustnými látkami při koncentraci 1 mg/ml ve vodě s 2 μl kyseliny octové (nebo 0,1 N kyseliny octové). Nerozpustné látky lze odstranit usazováním nebo odstřeďováním.
Výrobek v chladu zželíroval. Lze jej ještě použít?
To se může stát, ale výrobek to nepoškodí. Po zahřátí na pokojovou teplotu výrobek zkapalní. Před ředěním pro potahování nádob na kultury se ujistěte, že je dobře promíchán.
Lze všechny kolagenové produkty použít k výrobě trojrozměrných kolagenových gelů?
Ne, ne všechny kolagenové produkty mohou tvořit gely nebo být použity pro 3D aplikace. Vhodnost závisí na typu kolagenu, koncentraci a konkrétním složení. Zkontrolujte specifikace výrobku ve výše uvedených tabulkách, abyste se ujistili, že splňuje požadavky na tvorbu gelu a 3D aplikace.
Jak dlouho lze desky potažené kolagenem skladovat?
Neposkytujeme žádná doporučení ohledně skladování desek po nanesení povlaku. Vzhledem k tomu, že životnost potažených desek může ovlivnit několik faktorů, například vlhkost, měli by si zákazníci sami určit, zda a za jakých podmínek lze desky skladovat. Výrobek by neměl být vystaven teplotám vyšším než 50 °C.
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?