Srovnání výkonu při tvorbě sféroidů na destičkách Millicell^® s velmi nízkou přídržností

• Metody 3D buněčných kultur
• Atributy destiček Millicell^® ULA
• .Výsledky tvorby sféroidů
• Vyhodnocení kulatosti sféroidů
• Vyhodnocení kruhovitosti sféroidu
• Materiály

Metody 3D buněčných kultur

Běžnou in vitro alternativou k tradičnějším 2D buněčným kulturám nebo zvířecím modelům je 3D buněčná kultura má důležité rozmanité biologické aplikace včetně objevování nových léčiv, výzkumu rakoviny a neurověd. Modely 3D buněčných kultur lze obecně rozdělit do dvou kategorií: metody se scaffoldem a bez scaffoldu. Metoda bez scaffoldu umožňuje výzkumníkům pěstovat buňky bez jakýchkoli fyzických podpor, jako jsou hydrogely nebo jiné fyzické podložky.

Buňky pěstované bez scaffoldů vytvářejí 3D agregáty, které jsou také známé jako sféroidy. Tyto sféroidy jsou fyziologicky relevantní buněčné modely, protože buňky mohou přímo interagovat s jinými buňkami, extracelulární matrix (ECM) a jejich substráty. Vzhledem ke svému biologickému významu jsou sféroidy často využívány výzkumnými pracovníky v mnoha buněčných aplikacích, včetně vysoce výkonného vývoje léčiv a toxikologických screeningů.

Atributy destiček ULA Millicell^® 

Destičky ULA Millicell^®. Ultra-low Attachment plates jsou 96jamkové destičky, které jsou předem potaženy ultrahydrofilním polymerem, který podporuje spontánní tvorbu rovnoměrných sféroidů. Necytotoxický, stabilní a nepřilnavý povrch jamek s U-dnem podporuje samovolné sestavování sféroidů v prostředí s vysokou propustností.

Desky Millicell^® ULA mají vysokou optickou průhlednost, což umožňuje fixaci, barvení a zobrazování v jasném poli i konfokální mikroskopii. Destičky Millicell^® ULA se doporučují pro zvětšení menší než 20x, protože jamka ve tvaru U negativně ovlivňuje rovinnost ohniskové roviny při zvětšení větším než 20x. 

Obrázek 1. Millicell^® Ultra-low attachment plate. Číslování v horní a dolní části destičky usnadňuje orientaci v 96 jamkách a matný povrch pomáhá bojovat proti oslnění světlem a zlepšuje čtení destičky.

 

Na tomto místě ukazujeme podobnosti a rozdíly mezi destičkami Millicell^® ULA a konkurenční destičkou (Competitor A), abychom demonstrovali tvorbu sféroidů, kulatost a kruhovitost. Konkurenční deska A a deska Millicell^® ULA jsou obě 96jamkové desky s U-dnem:

Výsledky tvorby sféroidů 

Tvorba sféroidů pro tři buněčné linie A549, HeLa a MCF7 byla testována pomocí 96jamkových destiček se dnem U Millicell^® ULA a destiček Competitor A pro sledování uniformity. Protokol pro tvorbu sféroidů, zobrazování a analýzu naleznete zde.

Všechny tři buněčné linie úspěšně vytvořily sféroidy a rostly podobnou rychlostí na deskách Competitor A a Millicell^® ULA. Na obou deskách vytvořily buněčné linie A549 volnější sféroidy, které vyžadovaly několik dní ke zhutnění, než sféroid začal růst. Buněčné linie HeLa a MCF7 rostly lineárně a vytvořily sféroidy do 24 hodin od nasazení jak na deskách Competitor A, tak na deskách Millicell^® ULA. Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly mezi tvorbou sféroidů a růstem na deskách.

Obrázek 2. Tvorba sféroidů na destičkách Millicell^® ULA ve srovnání s tvorbou na destičce konkurenta A. A) buňky A549; B) buňky HeLa; C) buňky MCF7. U žádné z buněčných linií nebyl zjištěn významný rozdíl v tvorbě sféroidů.

Vyhodnocení kulatosti sféroidů 

Tvar sféroidů je důležitou analýzou používanou k vyhodnocení tvorby sféroidů. Kulatost sféroidu je běžná metoda používaná ke kvantifikaci a analýze tvaru sféroidu.

Pro více informací o výpočtu kulatosti sféroidu,navštivte náš protokol hodnocení kulatosti a kruhovitosti sféroidu.

Kruhovitost sféroidů vytvořených na destičkách Millicell^® ULA i na konkurenčních destičkách A byla vypočtena pomocí vzorce pro stanovení kulatosti. Podle tohoto vzorce budou mít dokonale kulaté sféroidy hodnotu kulatosti 1 nebo blízkou 1. Sféroidy vytvořené na destičkách Millicell^® ULA i na destičkách Competitor A měly stejnou kulatost u všech testovaných buněčných linií. Sféroidy na destičkách Millicell^® ULA měly hodnotu kulatosti 1 (Obrázek 3).

Obrázek 3. Zobrazení kulatosti sféroidů v jasném poli pro sféroidy vytvořené pomocí destiček Millicell^® ULA a destiček Competitor A. A) sféroid buněčné linie A549; B) sféroid buněčné linie HeLa; C) sféroid buněčné linie MCF7; D) Kvantifikace kulatosti sféroidů mezi destičkami Millicell^® ULA a destičkami Competitor A.

Vyhodnocení kulatosti sféroidů

K hodnocení tvorby sféroidů se v literatuře používá také kulatost sféroidů. Kruhovitost sféroidu se týká povrchu a hladkosti sféroidu. Drsné a hrbolaté sféroidy budou mít nižší hodnotu kruhovitosti než hladké sféroidy a hladší a kruhovitější sféroidy budou mít vyšší hodnotu kruhovitosti. Protože různé typy buněk mohou vytvářet různé tvary sféroidů, budou mít některé buněčné linie přirozeně vyšší hodnoty cirkularity.

Desky Millicell^® ULA a desky Competitor A vykazovaly rovnocenné výsledky bez statistického rozdílu mezi hodnotami cirkularity různých buněčných linií (Obrázek 4). Buněčná linie MCF7 vykazovala nižší hodnotu cirkularity než buněčné linie A549 a HeLa (Obrázek 4), ale tato hodnota byla mezi destičkami srovnatelná. 

Obrázek 4. Zobrazení kruhovitosti sféroidů v jasném poli pro sféroidy vytvořené pomocí destiček Millicell^® ULA a destiček Competitor A. A) sféroid buněčné linie A549; B) sféroid buněčné linie HeLa; C) sféroid buněčné linie MCF7; D) Kvantifikace kruhovitosti sféroidů mezi destičkami Millicell^® ULA a konkurenčními destičkami A.