Protokol enzymového testu hydroxyprolinu

Úvod

Tento protokol je vhodný pro kolorimetrickou detekci hydroxyprolinu v supernatantech buněčných a tkáňových kultur, moči, plazmě, séru a dalších biologických vzorcích pomocí soupravy Hydroxyproline Assay Kit (MAK008). Koncentrace hydroxyprolinu se stanoví reakcí oxidovaného hydroxyprolinu s 4-(dimetylamino)benzaldehydem (DMAB), jejímž výsledkem je kolorimetrický produkt (560 nm), úměrný přítomnému hydroxyprolinu. Lineární rozsah detekce tohoto testu je 0,2-1,0 µg.

Přečtěte si více informací

• Reagenty
• .Návod k přípravě
• Procedura
• Výsledky

Reagenty

• Oxidační pufr (10 ml)
• Koncentrát chloraminu T (0.6 ml)
• Roztok kyseliny chloristé/isopropanolu (5 ml)
• KoncentrátDMAB v DMSO (5 ml)
• Standard hydroxyprolinu, 1 mg/ml (0.1 ml)

Potřebná, ale nedodávaná činidla a vybavení

• 96jamková destička s plochým dnem - doporučuje se použít čiré destičky (produkt č. 2), které jsou součástí dodávky. M4436 nebo ekvivalentní) pro kolorimetrické testy.
• Spektrofotometrická čtečka vícejamkových destiček
• Koncentrovaná (37% nebo ~12 M) kyselina chlorovodíková (HCl, č. výrobku 320331 nebo ekvivalentní)
• Aktivní uhlí (č. výrobku 320331 nebo ekvivalentní). 242276 nebo ekvivalentní)
• 120 °C topný blok
• Pipeta kompatibilní s koncentrovanou HCl
• Centrifugální odparka nebo 60 °C pec
• Tlakotěsná lahvička s teflonovým uzávěrem nebo 2 ml polypropylenová lahvička.

Pokyny k přípravě

• Před otevřením lahvičky krátce odstřeďte.
• Pro přípravu činidel použijte ultračistou vodu.
• Pro zachování integrity činidla se vyhněte opakovaným cyklům zmrazování/rozmrazování.
• Oxidační pufr - před použitím nechte pufr dosáhnout pokojové teploty.
• KoncentrátDMAB - těsně před použitím zahřejte na pokojovou teplotu, aby se rozpustil zmrzlý roztok. Skladujte chráněné před světlem a vlhkostí při teplotě -20 °C.
  

Skladování / stabilita

Sada se dodává na mokrém ledu. Doporučuje se skladování při teplotě 2-8 °C, chráněné před světlem.

Procedura

Všechny vzorky a standardy by měly být provedeny ve dvou opakováních. Pro přípravu standardů a vzorků použijte ultračistou vodu.

Standardy hydroxyprolinu pro kolorimetrickou detekci

Zřeďte 10 µl standardního roztoku hydroxyprolinu o koncentraci 1 mg/ml s 90 µl vody a připravte standardní roztok o koncentraci 0,1 mg/ml. Přidejte 0, 2, 4, 6, 8 a 10 µl standardního roztoku hydroxyprolinu 0,1 mg/ml do 96jamkové destičky, čímž vznikne 0 (slepý pokus), 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 a 1,0 µg/jamku standardů.

Příprava vzorků

Pro přípravu vzorků séra nebo moči přeneste 100 µl vzorku do tlakotěsné lahvičky s uzávěrem s teflonovou vložkou nebo do 2,0 ml polypropylenové zkumavky. Přidejte 100 µl koncentrované kyseliny chlorovodíkové (HCl, ~12 M), pevně uzavřete a hydrolyzujte při 120 °C po dobu 3 hodin. Přidejte 5 mg aktivního uhlí, promíchejte a odstřeďujte při 13 000 x g po dobu 2 minut. Přeneste 10-50 µl supernatantu do 96jamkové destičky.

Homogenizujte 10 mg tkáně nebo buněk ve 100 µl vody a přeneste do tlakotěsné lahvičky s teflonovým uzávěrem nebo 2,0 ml polypropylenové zkumavky. Přidejte 100 µl koncentrované kyseliny chlorovodíkové (HCl, ~12 M), pevně uzavřete a hydrolyzujte při 120 °C po dobu 3 hodin. Přeneste 10-50 µl supernatantu do 96jamkové destičky.

Všechny jamky (vzorky a standardy) odpařte do sucha ve vakuu. Případně umístěte destičky do sušárny o teplotě 60 °C, aby se vzorky vysušily.

U neznámých vzorků se doporučuje otestovat několik ředění vzorků, aby se zajistilo, že hodnoty budou v lineárním rozsahu standardní křivky.

Reakce testu

Příprava testovacích činidel - následující 2 testovací činidla jsou stabilní po dobu 2-3 hodin po přípravě a měla by být připravena po přípravě vzorku, těsně před zahájením testu.

Směs chloraminu T/Oxidačního pufru - pro každou reakční jamku je zapotřebí 100 µl. Pro každou jamku přidejte 6 µl koncentrátu chloraminu T do 94 µl oxidačního pufru a dobře promíchejte.

Zředěné činidlo DMAB - pro každou reakční jamku je zapotřebí 100 µl. Do každé jamky přidejte 50 µl koncentrátu DMAB do 50 µl roztoku kyseliny chloristé/izopropanolu a dobře promíchejte.

1. Do každé jamky pro vzorek a standard přidejte 100 µl směsi chloraminu T a oxidačního pufru. Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě.
2. Přidejte 100 µl zředěného činidla DMAB do každé jamky pro vzorek a standard a inkubujte 90 minut při 60 °C.
3. Měřte absorbanci při 560 nm (A₅₆₀).

Výsledky

Výpočty

Podkladem pro analýzu je hodnota získaná pro 0 (slepý) standard hydroxyprolinu. Pozadí korigujte odečtením hodnoty slepého vzorku od všech odečtů. Hodnoty pozadí mohou být významné a musí být odečteny od všech odečtů.

Při vykreslení standardní křivky použijte hodnoty získané z příslušných standardů hydroxyprolinu. Množství hydroxyprolinu přítomného ve vzorcích lze určit ze standardní křivky.

Poznámka: Při každém provedení testu je třeba nastavit novou standardní křivku.

Koncentrace hydroxyprolinu

Sa/Sv = C
Sa = množství hydroxyprolinu v neznámém vzorku (µg) ze standardní křivky
. Sv = objem vzorku (µl) přidaný do jamek
C = koncentrace hydroxyprolinu ve vzorku

Výpočet vzorku

Množství hydroxyprolinu (Sa) = 5.84 µg
Objem vzorku (Sv) = 50 µl

Koncentrace hydroxyprolinu ve vzorku
5,84 µg/50 µl = 0,1168 µg/µl