Protokol pro přípravu a kultivaci kryokonzervovaných a proliferujících buněk PromoCell^®

Tyto produkty jsou dostupné v USA, Kanadě a vybraných evropských zemích.

• Protokol pro zacházení s kryokonzervovanými primárními buňkami a jejich kultivaci
• Protokol pro manipulaci s proliferujícími primárními buňkami a jejich kultivaci
• li>Protokol subkultivace primárních buněk

Protokol pro manipulaci s kryokonzervovanými primárními buňkami a jejich kultivaci

Důležité poznámky:

• Po příjezdu uložte kryokonzervované buňky do tekutého dusíku nebo je ihned vysaďte. Skladování při teplotě -80 °C není pro uchování buněk dostatečné a způsobuje jejich nevratné poškození.
• Manipulujte s nimi za použití aseptické techniky a laminárního proudění v kabinetu biologické bezpečnosti.

1. Příprava média
   Vypočítejte potřebnou plochu  kultivačního povrchu  podle hustoty pokovení (viz tabulka níže) a počtu buněk pro danou šarži uvedeného na certifikátu analýzy. Naplňte příslušný objem PromoCell^® růstového média (nejméně 9 ml na lahvičku s buňkami) do nádobek pro kultivaci buněk. Umístěte nádobky na 30 minut do inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂).
   
   
2. Rozmrazení buněk
   Vyjměte kryovialku z nádobky s tekutým dusíkem a okamžitě ji umístěte na suchý led - i pro krátkou přepravu. Pod laminárním prouděním ve skříni krátce otočte uzávěrem o čtvrt otáčky, abyste uvolnili tlak, a poté jej znovu utáhněte. Ponořte lahvičku na 2 minuty do vodní lázně (37 °C) až po šroubovací uzávěr. Dbejte na to, aby se do závitu šroubovacího uzávěru nedostala voda.
   
   
3. Dezinfikujte lahvičku a nasaďte buňky
   Kryovialku důkladně vypláchněte 70 % etanolem v laminární průtokové komoře. Poté odsajte přebytečný etanol z oblasti závitu šroubovacího uzávěru. Otevřete lahvičku a přeneste buňky do nádobky s buněčnou kulturou obsahující předehřáté médium z kroku 1.
   
   
4. Inkubujte buňky
   Umístěte nádobku do inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂) pro uchycení buněk. Po 16-24 hodinách a poté každé dva až tři dny vyměňte médium. Jakmile buňky dosáhnou 70-90 % konfluence, měly by být subkultivovány podle subkultivačního protokolu (viz níže).

 

Protokol pro manipulaci s proliferujícími primárními buňkami a jejich kultivaci

Primární buňky ProMoCell jsou k dispozici v proliferujícím (nekryokonzervovaném) formátu.

Důležité poznámky:

• Začněte ihned po dodání.
• Používejte aseptickou techniku a pracujte v kabinetu biologické bezpečnosti s laminárním prouděním.

1. Inkubujte buňky
   Vybalte kultivační nádobu, neotvírejte uzávěr a ihned ji umístěte do inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂) na 3 hodiny, aby se buňky zotavily z přepravy.
   
   
2. Vyměňte transportní médium
   Opatrně otevřete nádobu, opláchněte vnitřní stranu víčka 70% etanolem a nechte ji oschnout. Transportní médium z nádobky odsajte. Přidejte 10 ml příslušného média PromoCell^® Cell Growth Medium.
   
   
3. Kontrolujte a inkubujte buňky
   Zkontrolujte hustotu buněk. Otevřete víčko na půl otáčky a umístěte nádobu do inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂). Každé dva až tři dny vyměňte médium. Jakmile buňky dosáhnou 70-90 % konfluence, měly by být subkultivovány podle subkultivačního protokolu (viz níže).

 

Protokol subkultivace primárních buněk

Důležité poznámky:

• Používejte aseptickou techniku a laminární bezpečnostní kabinu.
• Vzhledem k nízkému obsahu séra nebo nepřítomnosti séra nejsou média PromoCell^® vhodná pro trypsinovou neutralizaci (například při subkultivaci buněk). Místo toho doporučujeme použít sadu DetachKit (C-41200, C-41210, C-41220), která obsahuje HEPES BSS, trypsin/EDTA a trypsin neutralizační roztok.

1. Připravte si činidla a promyjte buňky
   Umístěte soupravu PromoCell^® DetachKit na alespoň 30 minut při pokojové teplotě, aby se upravila teplota činidel. Opatrně odsajte médium z kultivační nádoby. Přidejte 100 µl roztoku HEPES BSS na cm² povrchu nádoby k promytí buněk a nádobu 15 sekund opatrně míchejte.
   
   
2. Oddělte buňky
   Poznámka: Doporučujeme oddělit buňky při pokojové teplotě.
   
   
   Opatrně odsajte HEPES BSS z kultivační nádoby. Přidejte 100 µl roztoku trypsinu/EDTA na cm² povrchu nádoby.  Uzavřete nádobu a prohlédněte buňky pod mikroskopem. Jakmile se buňky začnou oddělovat, jemně poklepejte na stěnu kultivační nádoby, aby se zbývající buňky uvolnily.
   
   
3. Neutralizujte trypsin a skliďte buňky
   Přidejte 100 µl roztoku pro neutralizaci trypsinu na cm² povrchu nádoby a jemně nádobou zatřeste, aby se promíchaly. Opatrně odsajte buněčnou suspenzi pipetou a přeneste ji do centrifugační zkumavky. Odstřeďujte buňky po dobu tří minut při 220 x g.
   
   
4. Inkubujte buňky
   Odlijte supernatant z buněčné pelety. Přidejte 1 ml příslušného PromoCell^® buněčného růstového média a jemným pipetováním nahoru a dolů buňky resuspendujte. Rozmístěte buňky podle doporučené hustoty výsevu do nových nádob na buněčné kultury obsahujících předehřáté Cell Growth Medium. Umístěte nádoby do inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂) a každé dva až tři dny vyměňte médium.

*katalogová čísla v této tabulce se týkají kryokonzervovaných buněk a médií v obalech připravených k použití