Test migrace a invaze endoteliálních buněk přes stěnu (Transwell)

Angiogeneze je přísně regulovaná buněčná událost, která je vyvážená pro- a antiangiogenními signály, včetně integrinů, chemokinů, angiopoetinů, látek vnímajících kyslík, spojovacích molekul a endogenních inhibitorů.⁴ Zatímco fyziologická angiogeneze je vysoce organizovaná, patologická angiogeneze je hůře kontrolovaná, cévy v reakci na onemocnění zřídka dozrávají, remodelují se nebo regredují.⁵ Protože migrace a invaze endoteliálních buněk jsou pro angiogenezi zásadní, takzvané transwellské buněčné migrační a invazní testy jsou užitečnými nástroji pro studium základních mechanismů angiogenních dějů. Migraci buněk lze jednoduše definovat jako proces, při kterém se buňky pohybují z jednoho místa na druhé řízené vnějšími biochemickými signály. Buněčná invaze naproti tomu měří schopnost endoteliálních buněk pohybovat se skrze 3D matrici (např. bazální membrány). Jedná se o složitý vícestupňový proces, který zahrnuje adhezi, proteolýzu složek ECM, reorganizaci mikroprostředí a migraci matrix.⁶

Při in vitro transmigrační test, známý také jako test v Boydenově komoře, se používá k měření migrace endoteliálních buněk podél cytokinového gradientu (chemotaxe) a k měření chemotaktické schopnosti testovaných látek in vitro. Zahrnuje dva prostory naplněné médiem a oddělené mikroporézní membránou. Buňky se zpravidla umístí do horního oddílu a nechají se migrovat přes póry membrány do dolního oddílu, kde jsou přítomny chemotaktické látky. Po příslušné inkubační době se membrána mezi oběma oddíly zafixuje a stanoví se počet buněk, které migrovaly na spodní stranu.

 in vitro invazivní test měří migraci buněk endotelu přes extracelulární matrici. Invazivní migrace je hlavním procesem v angiogenezi, ale hraje také významnou roli při patologických jevech, jako je vývoj rakoviny a metastazování.⁹ Stejně jako transwellský migrační test zahrnuje i test buněčné invaze dvě oddělení oddělená membránou s přesně definovanou velikostí pórů. Membrána je pokryta matricí, která napodobuje bazální membránu krevních cév. Potenciální chemotaktický faktor se umístí do jednoho oddělení a přes membránu se vytvoří gradient. Endotelové buňky zavedené do druhého oddílu rozkládají matrici a poté migrují podél tohoto gradientu. Po vhodné inkubační době lze po fixaci membrány a obarvení spočítat buňky, které přes ni migrovaly.⁹

Obrázek 1. Pracovní postup testů transmigrace a invaze endoteliálních buněk.

Protokoly testu transwellové migrace a invaze endoteliálních buněk

Protokol testu transmigrace

1. Připravte kulturu endoteliálních buněk. Rozložte endotelové buňky PromoCell v počtu 5X10³ buněk/cm²  (nebo podle doporučení v příslušné příručce k výrobku) do vhodné kultivační nádoby s použitím doporučeného endotelového růstového média. Kultivační médium vyměňujte každé 2 až 3 dny. Nechte buňky dosáhnout 70-90% konfluence.
2. Připravte testovací médium. Připravte odpovídající množství testovacího média přidáním 10% FBS do základního média pro endoteliální buňky (např. 9 ml základního média + 1 ml FBS).
3. Nastavte médium a činidla na pokojovou teplotu. Předehřejte testovací médium a součásti sady PromoCell DetachKit na pokojovou teplotu po dobu 1-2 hodin.
4. Připravte testovací médium. Rozpusťte testovanou látku v testovacím médiu. Na jednu jamku 24jamkové destičky by mělo být použito 750 μl testovacího média. Doporučujeme připravit jedno další testovací médium s 20 ng/ml VEGF nebo bFGF k použití jako pozitivní kontrola. Jako negativní kontrolu lze použít testovací médium bez jakéhokoli chemotaktického faktoru.
5. Připravte 24jamkové destičky a přidejte testovací médium. Do jamek 24jamkové destičky vložte vložky pro buněčné kultury. Do vnějšího prostoru každé jamky přidejte 750 μl testovacího média.
6. Oddělte endoteliální buňky. Endoteliální buňky by měly být konfluentní ze 70-90 %. Odstraňte médium z kultivační nádoby a promyjte buňky přidáním 200 μl/cm² PBS (D8537). Odstraňte PBS a přidejte 100 μl/cm² Trypsin/EDTA (T3924). Uzavřete nádobu a prohlédněte buňky pod mikroskopem. Když se buňky začnou oddělovat, jemně poklepejte na stěnu nádoby, aby se uvolnily zbývající buňky. Neutralizujte roztok trypsinu přidáním 100 μl/cm² Trypsin Neutralization Solution (T6414) a jemně třepejte kultivační nádobou po dobu 30 sekund.
7.  Spočítejte buňky. Přeneste buněčnou suspenzi do centrifugační zkumavky a roztočte zkumavku při 220 x g po dobu 4 minut při pokojové teplotě. Odeberte supernatant a buněčnou peletu resuspendujte v 5 ml testovacího média. Stanovte počet buněk podle svého standardního postupu.
8. Buňky nasaďte do vložek pro buněčné kultury. Zřeďte koncentraci buněk na 1x 10⁵ buněk/ml testovacím médiem. Opatrně přidejte 500 μl buněčné suspenze (= 5x10⁴ buněk) do vložek buněčných kultur ve 24jamkové destičce.
9. Začněte transmigrační experiment. Inkubujte buňky ve vložkách 24jamkové destičky ve zvlhčeném inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂) po dobu 3-6 hodin. Během inkubace se přes membránu vytvoří gradient testované látky. Buňky migrují póry podél gradientu na spodní stranu membrány a tam adherují.
10. Odstraňte nemigrované buňky na horní straně membrány. Opatrně odstraňte médium ze všech vložek buněčných kultur. Poté vyjměte vložky pomocí pinzety a odsajte médium z každé jamky. Po vrácení vložek do jamky odstraňte nemigrované buňky na horní straně membrány pomocí vatového tamponu. Do mezery mezi jamkou a vložkou napipetujte PBS.
11. Pokračujte ve fixaci a barvení migrovaných buněk.

Protokol testu invaze

1. Připravte si kulturu endoteliálních buněk. Rozložte endoteliální buňky PromoCell v počtu 5X10³ buněk/cm² ve vhodné kultivační nádobě s použitím doporučeného endoteliálního růstového média. Kultivační médium vyměňujte každé 2 až 3 dny. Nechte buňky dosáhnout 70-90% konfluence.
2. Připravte komůrky pro invazivní test a upravte média a činidla na vhodné teploty. Připravte vhodné množství testovacího média přidáním 10% FBS do základního média pro endoteliální buňky (např. 9 ml základního média + 1 ml FBS). Do každé jamky přidejte 750 μl testovacího média a 500 μl Matrigel/ECM gelu do vložky buněčné kultury. Umístěte 24jamkovou destičku do zvlhčeného inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂) na 1-2 hodiny.
3. Příprava testovacího média. Rozpusťte testovanou látku v testovacím médiu. Na jednu jamku 24jamkové destičky by mělo být použito 750 μl testovacího média. Doporučujeme připravit jedno další testovací médium s 20 ng/ml VEGF nebo bFGF k použití jako pozitivní kontrola. Jako negativní kontrolu lze použít testovací médium bez jakéhokoli chemotaktického faktoru.
4.  Přidejte testovací médium do jamek. Vyjměte vložky potažené Matrigel/ECM gelem z jamek 24jamkové destičky pomocí pinzety a nasajte testovací médium z každé jamky. Po vrácení destiček do jamek napipetujte 750 μl testovacího média do mezery mezi jamkou a destičkou.
5. Odstraňte endotelové buňky. Endotelové buňky by měly být 70-90 % konfluentní. Odstraňte médium z kultivační nádoby a promyjte buňky přidáním 200 μl/cm² PBS (D8537). Odstraňte PBS a přidejte 100 μl/cm² Trypsin/EDTA (T3924). Uzavřete nádobu a prohlédněte buňky pod mikroskopem. Když se buňky začnou oddělovat, jemně poklepejte na stěnu nádoby, aby se uvolnily zbývající buňky. Neutralizujte roztok trypsinu přidáním 100 μl/cm² roztoku pro neutralizaci trypsinu (T6414) a jemně třepejte kultivační nádobou po dobu 30 sekund.
6. Spočítejte buňky. Přeneste buněčnou suspenzi do centrifugační zkumavky a roztočte zkumavku při 220 x g po dobu 4 minut při pokojové teplotě. Odstraňte supernatant a buněčnou peletu znovu rozpusťte v 5 ml testovacího média. Stanovte počet buněk podle svého standardního postupu.
7. Buňky nasaďte do vložek pro buněčné kultury potažených gelem Matrigel/ECM. Zřeďte koncentraci buněk na 1x10⁵ buněk/ml testovacím médiem. Odstraňte testovací médium z vložek potažených materiálem Matrigel, aniž byste se dotkli povrchu potaženého materiálem Matrigel. Opatrně přidejte 500 μl buněčné suspenze (= 5x10⁴ buněk) do vložek pro buněčné kultury.
8. Spustit invazní experiment. Inkubujte buňky ve vložkách potažených Matrigelem ve zvlhčeném inkubátoru (37 °C, 5 % CO₂) po dobu 16-28 hodin. Během inkubace se přes membránu vytvoří gradient testované látky. V případě pozitivní stimulace testovanou látkou buňky degradují matrici, migrují póry podél gradientu na spodní stranu membrány a tam adherují.
9. Odstraňte nemigrované buňky na horní straně membrány. Opatrně odstraňte médium ze všech vložek potažených Matrigel/ECM gelem. Poté vložky vyjměte pomocí pinzety a z každé jamky odsajte médium. Po vrácení vložek do jamky odstraňte nemigrované buňky na horní straně membrány pomocí vatového tamponu. Do mezery mezi jamkou a vložkou napipetujte 750 μl PBS.
10. Pokračujte ve fixaci a barvení migrovaných buněk.

Analýza migrovaných buněk

Fixace a barvení buněk
1. Proveďte analýzu migrovaných buněk. Fixujte membrány a vysušte vložky.  Opatrně odstraňte PBS z jamek a přidejte do jamek 750 μl studeného metanolu (34860) (4 °C). Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě. Opatrně odstraňte metanol a počkejte 30 minut. Během této doby se membrána vysuší na vzduchu. Po vysušení lze membránu uložit při teplotě 4 °C a zpracovat ji později.
2. Ochrana buněk. Do jamek přidejte 750 μl krystalové violeti (V5265) a inkubujte 20 minut při pokojové teplotě.
3. V případě, že se membrána nachází na povrchu, přidejte do jamek krystalovou violeť. Omyjte membránu. Opatrně odstraňte barvicí roztok a třikrát ji důkladně promyjte destilovanou vodou.
4. Odeberte barvicí roztok a omyjte membránu. Pokračujte v analýze.

Analýza

1. Vizuální kvantifikace. Naplňte 750 μl destilované vody do jamek 24jamkové destičky a spočítejte migrující buňky na spodním místě membrány pomocí inverzního mikroskopu.
2. Kolorimetrická kvantifikace pomocí čtečky mikrodestiček. Do jamek naplňte 750 μl 10% kyseliny octové (A6283) a inkubujte 30 sekund za opatrného protřepávání 24jamkové destičky. Buňky na membráně budou lyzovány kyselinou octovou a Crystal Violet v buňkách se uvolní. Vyjměte vložku z 24jamkové destičky a odečtěte optickou hustotu 10% kyseliny octové při vlnové délce 595 nm pomocí mikrodestičkové čtečky.

Výsledky

Obrázek 2. Buněčná migrace endoteliálních buněk stimulovaná VEGF in vitro. Buňky, které migrovaly přes membránu bez VEGF (vlevo) a s 20 ng/ml VEGF v médiu (vpravo). Buňky jsou obarveny krystalovou violetí.

Odkazy

1. Van Hove AH, Benoit DSW. Depot-Based Delivery Systems for Pro-Angiogenic Peptides: A Review. Front. Bioeng. Biotechnol.. 3 https://doi.org/10.3389/fbioe.2015.00102

2. DeCicco-Skinner KL, Henry GH, Cataisson C, Tabib T, Gwilliam JC, Watson NJ, Bullwinkle EM, Falkenburg L, O'Neill RC, Morin A, et al. Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis. JoVE.(91): https://doi.org/10.3791/51312

3. Adams RH, Alitalo K. 2007. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8(6):464-478. https://doi.org/10.1038/nrm2183

4. BOUIS D, KUSUMANTO Y, MEIJER C, MULDER N, HOSPERS G. 2006. A review on pro- and anti-angiogenic factors as targets of clinical intervention. Pharmacological Research. 53(2):89-103. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2005.10.006

5. Staton CA, Reed MWR, Brown NJ. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. 90(3):195-221. https://doi.org/10.1111/j.1365-2613.2008.00633.x

6. Kramer N, Walzl A, Unger C, Rosner M, Krupitza G, Hengstschläger M, Dolznig H. 2013. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752(1):10-24. https://doi.org/10.1016/j.mrrev.2012.08.001

7. Boyden S. 1962. THE CHEMOTACTIC EFFECT OF MIXTURES OF ANTIBODY AND ANTIGEN ON POLYMORPHONUCLEAR LEUCOCYTES. 115(3):453-466. https://doi.org/10.1084/jem.115.3.453

8. Chen H. 2005. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 29415-22.

9. Hulkower KI, Herber RL. Cell Migration and Invasion Assays as Tools for Drug Discovery. Pharmaceutics. 3(1):107-124. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics3010107

10. Poldervaart MT, Gremmels H, van Deventer K, Fledderus JO, Öner F, Verhaar MC, Dhert WJ, Alblas J. 2014. Prolonged presence of VEGF promotes vascularization in 3D bioprinted scaffolds with defined architecture. Journal of Controlled Release. 18458-66. https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2014.04.007

11. Mori S, Tran V, Nishikawa K, Kaneda T, Hamada Y, Kawaguchi N, Fujita M, Takada YK, Matsuura N, Zhao M, et al. A Dominant-Negative FGF1 Mutant (the R50E Mutant) Suppresses Tumorigenesis and Angiogenesis. PLoS ONE. 8(2):e57927. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0057927

12. Hussain S, Slevin M, Ahmed N, West D, Choudhary M, Naz H, Gaffney J. 2009. Stilbene glycosides are natural product inhibitors of FGF-2-induced angiogenesis. BMC Cell Biol. 10(1):30. https://doi.org/10.1186/1471-2121-10-30

13. Jia H, Bagherzadeh A, Bicknell R, Duchen MR, Liu D, Zachary I. 2004. Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)-D and VEGF-A Differentially Regulate KDR-mediated Signaling and Biological Function in Vascular Endothelial Cells. J. Biol. Chem.. 279(34):36148-36157. https://doi.org/10.1074/jbc.m401538200

14. Grutzmacher C, Park S, Zhao Y, Morrison ME, Sheibani N, Sorenson CM. 2013. Aberrant production of extracellular matrix proteins and dysfunction in kidney endothelial cells with a short duration of diabetes. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 304(1):F19-F30. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00036.2012

15. Bharadwaj AS, Appukuttan B, Wilmarth PA, Pan Y, Stempel AJ, Chipps TJ, Benedetti EE, Zamora DO, Choi D, David LL, et al. 2013. Role of the retinal vascular endothelial cell in ocular disease. Progress in Retinal and Eye Research. 32102-180. https://doi.org/10.1016/j.preteyeres.2012.08.004

16. Mierke CT. 2011. Cancer Cells Regulate Biomechanical Properties of Human Microvascular Endothelial Cells. J. Biol. Chem.. 286(46):40025-40037. https://doi.org/10.1074/jbc.m111.256172

17. Dorward HS, Du A, Bruhn MA, Wrin J, Pei JV, Evdokiou A, Price TJ, Yool AJ, Hardingham JE. 2016. Pharmacological blockade of aquaporin-1 water channel by AqB013 restricts migration and invasiveness of colon cancer cells and prevents endothelial tube formation in vitro. J Exp Clin Cancer Res. 35(1): https://doi.org/10.1186/s13046-016-0310-6