Průvodce protokolem: Imunofluorescenční barvení celých organoidů pomocí protilátek

Organoidy mají složitou trojrozměrnou strukturu a jsou zabudovány v ECM hydrogely což znesnadňuje jejich charakterizaci. Imunofluorescenční (IF) barvení organoidů protilátkami lze provádět za účelem vizualizace molekulárních markerů buněčného chování, proliferace, diferenciace, zdraví a identity buněk. Celoplošné imunobarvení je určeno pro malé kousky tkáně bez rozřezání a metody jsou velmi podobné imunocytochemickému (ICC) nebo imunohistochemickému (IHC) barvení kryosekcí. Celoplošné barvení organoidů lze použít k charakterizaci na základě protilátek. V tomto protokolu barvení organoidů jsou podrobně popsány metody fixace, permeabilizace a barvení organoidů v celku pro analýzu pomocí imunofluorescenční konfokální mikroskopie.

Obrázek 1. Imunofluorescence organoidů pomocí protilátek. Lidské epiteliální střevní a plicní organoidy obarvené protilátkami proti acetyl-α-tubulinu (A), α-karbonanhydráze IV (B) a Sox-9 (AB5535) (C).

Protokol barvení organoidů

1. Odstraňte médium z organoidní kultury a jemně ho 2x promyjte 1X PBS (D8537).
2. Upevněte 30-40 organoidních kopulí Matrigelu v misce o průměru 10 cm pomocí 15-20 ml 4% PFA (1.00496) na 30-60 minut při pokojové teplotě.  
   Poznámka: Matrigel se při fixaci v PFA částečně rozpustí. 
3. Miskou občas zatočte, aby se oddělily kopule Matrigela a organoidy se z Matrigela uvolnily. 
   Poznámka: ne všechny organoidy se z Matrigela uvolní.
4. Přelijte 15-20 ml fixačního činidla z 10cm misky do 50ml kónické zkumavky a nechte organoidy gravitačně usadit na dně zkumavky (~10-15 minut). 
5. Po gravitačním usazení organoidů na dně 50 ml kónické zkumavky opatrně odsajte fixační činidlo a snažte se přitom zabránit aspiraci organoidních pelet. 
6. Přidejte 15-20 ml 1X PBS (D8537) do misky z kroku 4 a nechte 15-20 minut odstát při pokojové teplotě.
7. Po uplynutí 15-20 minut misku roztočte, aby se kopulky Matrigela dále oddělily, a nalijte 1X PBS (D8537) do 50ml kónické zkumavky obsahující organoidní pelety z kroku 5.
8. Zopakujte kroky 5-7 ještě třikrát.
9. Odstřikujte roztok, aniž byste poškodili organoidní peletu, a přidejte 5 ml 1X PBS (D8537) dávkováním na stranu 50ml kónické zkumavky obsahující organoidní peletu a otáčejte zkumavkou, abyste organoidní peletu resuspendovali.  
   Poznámka: nepipetujte pipetou nahoru a dolů. Tím se většina organoidů rozbije.
10.  Přímo nalijte 5 ml 1X PBS (D8537) obsahující organoidní shluky do 10 cm misky obsahující neoddělené organoidní kopule Matrigelu.
11. Do 50ml kónické zkumavky přidejte dalších 5 ml 1X PBS (D8537), abyste zachytili co nejvíce organoidních shluků, a přímo je nalijte do 10cm misky s organoidy.
12. Pokud nebudete používat ihned, uzavřete 10 cm misku parafilmem a uložte ji do chladničky při 4 °C až na 1 měsíc. 
13. Když budete připraveni provést imunofluorescenční barvení, vyjměte 10 cm misku obsahující fixované organoidy z chladničky a pozorujte je pod pitevním mikroskopem.
14. Zastřihněte špičku pipety o objemu 1 ml tak, aby byl tubus dostatečně velký na nasátí organoidů, aniž by došlo k jejich stržení nebo rozbití.
15. Přeneste organoidy (1-4) na 8jamkové komůrkové sklíčko a odstraňte zbytky 1X PBS (D8537) pipetou P-200.  Vyhněte se nasátí organoidů a jejich střihnutí přes neříznutou špičku P-200.
16. Permeabilizujte fixované organoidy 0,5 ml blokovacího pufru (5% koňské sérum + 0.5% Triton X-100 v 1X PBS) přes noc při 4 °C nebo 2-4 hodiny při pokojové teplotě.  Poznámka: doporučuje se použít sérum od stejného druhu, jako je hostitel sekundární protilátky.
17. Odstraňte blokovací pufr z komůrkového sklíčka obsahujícího organoidy pipetou P-200. Vyvarujte se pipetování organoidů nahoru přes špičku P-200.
18. Připravte primární protilátky  (300-500 µl) nebo přímo konjugované protilátky  (300-500 µl) v blokovacím pufru.
19. Přidejte naředěné protilátky do příslušně označené jamky obsahující organoidy.
20. Nechte inkubovat při 4 °C přes noc.
21. Na druhý den promyjte 3x 1X PBS (D8537) po dobu 10-15 minut při každém promytí. Poznámka: Pokud používáte přímo konjugované protilátky, vzorky jsou připraveny k zobrazení na konfokálním mikroskopu.
22. Při použití nekonjugovaných primárních protilátek připravte sekundární protilátky  (300-500 µl) v blokovacím pufru a k příslušně označeným vzorkům.
23. Doporučujeme barvit sekundární protilátkou přes noc při 4 °C.
24. Na druhý den 3x promyjte 1X PBS (D8537) po dobu 10-15 minut při každém promytí.
25. Odstraňte blokovací pufr z každé jamky obsahující organoidy pipetou P-200.  Vyvarujte se pipetování organoidů nahoru přes špičku P-200.
26. Připravte jaderné barvení přidáním DAPI (D9542) v koncentraci 5 µg/ml v 1X PBS (300-500 µl na vzorek).
27. Přidejte barvicí roztok DAPI ke každému vzorku a nechte inkubovat při pokojové teplotě po dobu 15-20 minut.
28. 3× promyjte 1X PBS (D8537) po dobu 10-15 minut při každém promytí.
29. Vzorky jsou připraveny k zobrazení na konfokálním mikroskopu.