Gelová elektroforéza

Existuje několik metod gelové elektroforézy proteinů, přičemž každá metoda poskytuje odlišné informace o proteinech, které vás zajímají:

SDS-PAGE

Dodecylsíran sodný (SDS) - polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) umožňuje separaci proteinů na základě molekulové hmotnosti. Při této metodě je do běžícího pufru přidán detergent SDS. SDS propůjčuje proteinům čistý záporný náboj, čímž maskuje jejich vlastní náboj. Při separaci proteinů v přítomnosti SDS a denaturačních činidel jsou proteiny méně kulovité a více lineární. Výsledkem je, že rychlost, s jakou proteiny navázané na SDS migrují gelem, závisí především na jejich velikosti, což umožňuje odhadnout hmotnost molekul porovnáním s proteinovými standardy.

Nativní stránka

Při nativní polyakrylamidové gelové elektroforéze se proteiny separují způsobem, který zachovává jejich nativní konformaci (terciární strukturu), interakce mezi podjednotkami (kvartérní strukturu a interakce protein-protein) a biologickou aktivitu. Při této metodě se proteiny připravují a zpracovávají za neredukujících a nedenaturačních podmínek. Pohyblivost proteinů je dána komplexní kombinací faktorů, protože každý protein může migrovat směrem k některé z elektrod v závislosti na svém náboji a rychlostí závislou na jeho tvaru a vazebném chování. Z tohoto důvodu se nativní PAGE pro stanovení molekulové hmotnosti nedoporučuje. Nativní PAGE se obvykle používá v aplikacích, které vyžadují purifikaci aktivního proteinu nebo detekci pomocí protilátky, která rozpoznává pouze nativní formu proteinu.

Isoelektrická fokusace (IEF)

Isoelektrická fokusace využívá elektrické pole i gradient pH k oddělení proteinů podle jejich nativního izoelektrického bodu (pI). Jak se proteiny pohybují přes gradient pH, mění se jejich čistý náboj. Pod elektrickým polem každý protein migruje k pH, kde je jeho čistý náboj nulový (označovaný jako izoelektrický bod proteinu). Během separačního procesu se bílkoviny ve vzorku hromadí, neboli "fokusují", na specifických a předvídatelných místech v gelu. Izoelektrická fokusace se používá při identifikaci proteinů ze složitých vzorků (např, buněčné a tkáňové lyzáty, plazma), analýze posttranslačních modifikací a separaci vzorků pro analýzu hmotnostní spektrometrií.

2D PAGE

Dvourozměrná polyakrylamidová gelová elektroforéza umožňuje rozlišení bílkovin podle jejich vlastního izoelektrického bodu (pI) i hmotnosti. Rozdělení podle pI probíhá prostřednictvím izoelektrické fokusace (IEF). Rozdělení podle hmotnosti se provádí pomocí SDS-PAGE. 2-D PAGE poskytuje největší rozlišení pro analýzu proteinů a běžně se používá v proteomickém výzkumu k rozlišení stovek až tisíců proteinů na jediném gelu.