Nanomateriały srebra do zastosowań biologicznych

Steven J. Oldenburg*, Aaron E. Saunders

nanoComposix, Inc., San Diego, California 92111 *

steve.oldenburg@nanocomposix.com

Nanomateriały srebra mają unikalne właściwości fizyczne, chemiczne i optyczne, które są obecnie wykorzystywane w wielu różnych zastosowaniach biologicznych. Odrodzenie zainteresowania użytecznością srebra jako szeroko zakrojonego środka przeciwdrobnoustrojowego doprowadziło do opracowania setek produktów, które zawierają nanocząstki srebra zapobiegające rozwojowi bakterii na powierzchniach. Dodatkowo, nanocząsteczki srebra mają kolor optyczny, który jest funkcją ich wielkości i kształtu. Silne sprzężenie nanocząstek srebra z określonymi długościami fal padającego światła można wykorzystać do opracowania ultra jasnych cząsteczek reporterowych, wysoce wydajnych pochłaniaczy termicznych i nanoskalowych "anten", które mogą wzmacniać siłę lokalnego pola elektromagnetycznego. Tutaj podsumowujemy, w jaki sposób precyzyjna inżynieria rozmiaru i kształtu nanocząstek srebra umożliwia szeroki zakres zastosowań biologicznych.

Chemia powierzchni, morfologia i właściwości optyczne nanomateriałów srebra

Warunki reakcji podczas syntezy nanomateriałów srebra można dostosować  w celu wytworzenia koloidalnych nanocząstek srebra o różnych morfologiach,  w tym monodyspersyjnych nanosfer, trójkątnych pryzmatów, nanopłytek,  sześcianów, drutów i nanoprętów. W przypadku zastosowań biologicznych, chemia powierzchni, morfologia i właściwości optyczne nanocząstek srebra muszą być dokładnie kontrolowane, aby uzyskać pożądaną funkcjonalność w środowisku docelowym.

Chemia powierzchni

W wielu zastosowaniach biologicznych pożądane jest dostrojenie stabilności koloidalnej w różnych buforach lub mediach, lub zróżnicowanie wiązania lub wychwytu cząstek poprzez interakcje powierzchniowe. Skład chemiczny powierzchni cząstek (tj. siła wiązania, grupy funkcjonalne i rozmiar środków zamykających) może być zmieniany, aby zapewnić dodatkowy poziom kontroli nad zachowaniem cząstek. W środowisku wodnym wiele nanocząstek jest stabilizowanych elektrostatycznie poprzez dodanie naładowanych cząstek na powierzchni cząstek. Rodzaj i gęstość ładunków można określić poprzez pomiar potencjału zeta koloidu. Zazwyczaj potencjał zeta nanocząstek srebra jest ujemny ze względu na cząsteczki związane z powierzchnią, takie jak cytrynian. Poprzez wystawienie nanocząstki na działanie silniej koordynujących ligandów (często zawierających funkcje tiolowe lub aminowe), nowe czynniki ograniczające mogą wiązać się z powierzchnią i  zmieniać funkcjonalność chemiczną i potencjał zeta nanocząstki.Zastąpienie jonów cytrynianowych krótkołańcuchowymi cząsteczkami glikolu polietylenowego (mPEG) o zakończeniach metoksylowych zapewnia potencjał zeta bliski neutralnemu, podczas gdy powlekanie cząstek rozgałęzioną polietylenoiminą (BPEI)  tworzy powierzchnię gęstą aminowo o wysoce dodatnim potencjale zeta.

Morfologia i właściwości optyczne

Srebro i inne nanocząstki metali szlachetnych wykazują silną interakcję ze światłem, ponieważ elektrony na powierzchni metalu ulegają zbiorowej oscylacji, gdy są wzbudzane przez światło o określonej długości fali. Oscylacja ta jest znana jako rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR) i powoduje, że intensywność absorpcji i rozpraszania nanocząstek srebra jest znacznie wyższa niż w przypadku nanocząstek nieplazmonicznych o identycznych rozmiarach. Właściwości absorpcyjne i rozpraszające nanocząstek srebra można regulować poprzez kontrolowanie wielkości cząstek, kształtu i lokalnego współczynnika załamania światła w pobliżu powierzchni cząstek.

Właściwości optyczne sferycznych nanocząstek srebra są wysoce zależne od średnicy i jednorodności nanocząstek, które można kontrolować poprzez staranne dostosowanie warunków wytwarzania w celu uzyskania cząstek o kontrolowanym rozmiarze ze współczynnikami zmienności (odchylenie standardowe średnicy/średnia średnica) mniejszymi niż 15% (Rysunek 1A). Na Rysunku 1B przedstawiono widma 10 rozmiarów nanocząstek srebra przy identycznych stężeniach masowych (0,02 mg/ml). Mniejsze   nanosfery absorbują głównie światło z pikami w pobliżu 400 nm, podczas gdy większe   sfery wykazują zwiększone rozpraszanie, szersze piki widmowe i piki   intensywności przy dłuższych falach.

Rysunek 1. A) Transmisyjne mikrografy elektronowe (TEM) jednorodnych nanocząstek srebra o średnicy 20 nm, 60 nm i 100 nm. B) Widma ekstynkcji (suma rozpraszania i absorpcji) nanocząstek srebra o średnicach w zakresie 10-100 nm przy stężeniach masowych 0,02 mg/ml.

Nanopłytki srebra są nanocząstkami w kształcie płytek rezonansu plazmonów powierzchniowych (SPR) (Rysunek 2A), które mają wyjątkowo duże przekroje pochłaniania i rozpraszania w widzialnych i bliskich podczerwieni obszarach widma. Precyzyjnie kontrolując średnicę i grubość płytki, rezonans optyczny nanopłytki można dostroić tak, aby osiągał wartość szczytową przy określonych długościach fal (550 nm-950 nm, Rysunki 2B i 2C). Nanopłytki mają zastosowanie w powierzchniowo wzmocnionym rozpraszaniu ramanowskim (SERS), fotowoltaice, wykrywaniu molekularnym i terapiach fototermicznych.

Rysunek 2. A) Obraz nanopłatków srebra z transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). B) Dyspersje nanopłatków wykazują kolory, które odzwierciedlają zdolność do dostrajania rezonansu plazmonowego nanopłatków w widzialnej i bliskiej podczerwieni części widma (C).

Spektroskopia wzmocniona powierzchniowo

Inne zastosowania nanocząstek srebra w zastosowaniach biologicznych opierają się na wykorzystaniu wzmocnionego pola elektromagnetycznego na powierzchni i w pobliżu powierzchni nanocząstki srebra. Przy długości fali rezonansowej plazmonów, nanocząstki srebra działają jak anteny w nanoskali, zwiększając intensywność lokalnego pola elektromagnetycznego.

Jedną z technik spektroskopowych, która korzysta ze wzmocnionych pól elektromagnetycznych, jest spektroskopia Ramana, w której cząsteczki mogą być identyfikowane na podstawie ich unikalnych trybów wibracyjnych. Podczas gdy wewnętrzne rozpraszanie ramanowskie fotonów z cząsteczek jest słabe i wymaga długiego czasu pomiaru w celu uzyskania widma ramanowskiego, powierzchniowo wzmocnione rozpraszanie ramanowskie (SERS) z cząsteczek w pobliżu powierzchni plazmonicznych nanocząstek metalu oferuje znacznie wzmocnione sygnały ramanowskie. Efekt SERS może wzmocnić rozpraszanie Ramana związanych cząsteczek nawet o 14 rzędów wielkości, umożliwiając wykrywanie nawet pojedynczych cząsteczek.^1,2 Wzmocnienie jest napędzane przez wysokie natężenia pola elektrycznego (lub "gorące punkty") tworzone w miejscach na powierzchni nanocząstki  i dlatego jest wysoce zależne od geometrii nanocząstki, cech powierzchni  i konkretnej pozycji cząsteczki. Nanocząstki metalu wykazujące SERS z powiązanych cząsteczek (nanotagi SERS) zostały wykorzystane jako etykiety w szeregu zastosowań i platform biomedycznych, w tym w testach immunologicznych, wykrywaniu sekwencji kwasów nukleinowych, in vitro obrazowaniu komórkowym, in vivo obrazowaniu i cytometrii przepływowej.

Rysunek 3. A) Organiczny fluorofor przyłączony bezpośrednio do metalowego podłoża zazwyczaj wykazuje wygaszoną fluorescencję, ale silne powierzchniowo wzmocnione widmo Ramana (SERS). B) Oddalenie fluoroforu od powierzchni metalu skutkuje fluorescencją wzmocnioną powierzchniowo (SEF).

Zwiększone zlokalizowane pole rozciąga się poza powierzchnię nanocząstki i umieszczając fluorofor w niewielkiej odległości od powierzchni nanocząstki srebra, powoduje zjawisko znane jako wzmocniona fluorescencja powierzchniowa (SEF). SEF została po raz pierwszy zaobserwowana w latach siedemdziesiątych XX wieku i może zwiększyć intensywność emisji fluoroforu o rzędy wielkości.³ Wzmocnienie fluoroforu można przypisać dwóm efektom: 1) ogniskowaniu przychodzącego światła ze względu na duże przekroje poprzeczne absorpcji i rozpraszania cząsteczki plazmonicznej oraz  2) zmniejszeniu czasu życia fluorescencji fluoroforu, co pozwala  stanowi wzbudzonemu powrócić do stanu podstawowego z wyższą częstotliwością.  Łącznie te dwa zjawiska łagodzą dwie wady wspólne dla  cząsteczek barwników organicznych: 1) niski przekrój absorbancji cząsteczek oraz 2) powolny czas cyklu wzbudzenia i emisji na cząsteczkę. Aby zmaksymalizować wzmocnienie fluorescencji fluoroforu, właściwości optyczne nanocząstki metalu i geometria nanotagu SEF muszą być starannie zaprojektowane poprzez precyzyjne kontrolowanie rozmiaru, kształtu i składu cząstek metalu, a także rozkładu fluoroforu w pobliżu powierzchni cząstek.

Schemat różnych strategii przyłączania niezbędnych do osiągnięcia optymalnych efektów SERS i SEF z cząsteczką barwnika pokazano na Rysunku 3. Przyłączenie cząsteczki barwnika do nanocząstki metalu zazwyczaj powoduje wygaszenie emisji z powodu transferu energii między stanem wzbudzonym fluoroforu a stanami elektronowymi metalu. W tym przypadku widmo Ramana cząsteczki jest silnie wzmocnione ze względu na wysokie pole elektromagnetyczne na powierzchni cząsteczki (Rysunek 3A). Oddalenie fluoroforu nieco od powierzchni cząsteczki zapobiega  wygaszaniu fluorescencji i  ze względu na wysokie lokalne pole elektromagnetyczne  powoduje duży wzrost fotoemisji z  cząsteczki (Rysunek 3B).

Zastosowania przeciwdrobnoustrojowe

Przeciwdrobnoustrojowe działanie srebra można prześledzić wstecz do Greków i Rzymian, którzy przedłużyli zdatność wody do picia poprzez przechowywanie jej w srebrnych naczyniach. Jony srebra są uwalniane ze ścianek pojemnika i zapewniają efekt przeciwdrobnoustrojowy poprzez interakcję jonów srebra z grupami tiolowymi ważnych enzymów bakteryjnych i białek. Wpływa to na oddychanie komórkowe i transport jonów przez błony, powodując śmierć komórki.^4,5 Zaproponowano również dodatkowe ścieżki przeciwdrobnoustrojowe specyficzne dla toksyczności nanocząstek srebra. Nanocząstki srebra mogą zakotwiczać się, a następnie przenikać przez ścianę komórkową bakterii, prowadząc do szkodliwych zmian strukturalnych w błonie komórkowej.⁶ Generowanie reaktywnych form tlenu na powierzchni nanocząstek srebra może powodować stres oksydacyjny, zapewniając dalszy mechanizm uszkodzenia komórek.⁷ Specyficzna toksyczność dla bakterii, przy jednoczesnym zachowaniu niskiej toksyczności dla ludzi, doprowadziła do integracji nanocząstek srebra w szerokiej gamie produktów, w tym w opatrunkach na rany, materiałach opakowaniowych i przeciwporostowych powłokach powierzchniowych.

Głównym mechanizmem działania przeciwdrobnoustrojowego nanocząstek srebra jest zapewnienie źródła jonów srebra o dużej powierzchni. W środowisku wodnym cząsteczki utleniają się w obecności tlenu i protonów zgodnie z reakcją stechiometryczną

.

uwalniając jony Ag+ w miarę rozpuszczania się powierzchni cząstek. Wraz ze wzrostem stężenia jonów srebra w roztworze zbliża się stan równowagi, a rozpuszczanie srebra spowalnia. Jeśli jednak w środowisku lokalnym znajdują się cząsteczki, które mają powinowactwo do srebra, takie jak tiole lub chlor, stężenie wolnych jonów srebra w roztworze pozostaje niskie, a rozpuszczanie jonów srebra z nanocząstek srebra jest kontynuowane. Długotrwała skuteczność przeciwdrobnoustrojowa nanocząstek srebra zależy od utrzymania skutecznego stężenia jonów srebra w wielu różnych roztworach.

Szybkości uwalniania jonów srebra

Szybkości uwalniania jonów srebra z nanocząstek srebra zależą od wielu czynników, w tym wielkości nanocząstek, kształtu, środka zamykającego, stanu agregacji i środowiska. Najmniejsze rozmiary cząstek mają zazwyczaj najszybsze tempo uwalniania jonów ze względu na wysoką energię powierzchniową wysoce zakrzywionych lub naprężonych powierzchni nanocząstek. Kształt również przyczynia się do szybkości uwalniania jonów. Rysunek 4 przedstawia profile uwalniania jonów z różnej wielkości sferycznych nanocząstek i nanopłytek srebra.

 

.

Rysunek 4. Uwalnianie jonów srebra w funkcji czasu dla kulek i nanopłatków srebra o różnych rozmiarach. W każdej próbce zastosowano taką samą masę srebra.

Zgodnie z oczekiwaniami, mniejsze (o średnicy 10 nm) nanosfery srebra wykazują znacznie wyższą szybkość uwalniania i końcowe stężenie jonów niż większe (o średnicy 110 nm) nanosfery. Anizotropowe nanopłytki srebra mają znacznie inne szybkości uwalniania jonów niż cząstki sferyczne. Duże nanopłytki srebra, o średniej średnicy 150 nm, mają prawie taki sam profil stężenia srebra w czasie jak sferyczne cząstki srebra o średnicy 10 nm, a płytki o średnicy 35 nm wykazują stężenie jonów srebra prawie dwukrotnie wyższe niż mniejsze srebrne kule.

Funkcjonalizacja powierzchni również odgrywa rolę w szybkości uwalniania jonów, przy czym ściśle związane środki ograniczające zawierające tiol ogólnie zmniejszają szybkość uwalniania w porównaniu z łatwiejszymi do przemieszczenia cząsteczkami stabilizującymi, takimi jak cytrynian. Agregacja cząstek również zmniejsza szybkość uwalniania jonów, ale większy wpływ agregacji ma zmiana kinetyki i dystrybucji z powodu osiadania. Czynnikiem, który najbardziej wpływa na szybkość uwalniania jonów jest środowisko nanocząstek. Podwyższone temperatury, obecność chloru, tioli i tlenu wpływają na szybkość uwalniania. W niektórych mediach fizjologicznych całkowite rozpuszczenie nanocząstek srebra może nastąpić w ciągu zaledwie kilku godzin.

Dzięki zrozumieniu, w jaki sposób właściwości fizyczne i chemiczne nanocząstek srebra wpływają na szybkość uwalniania, kompozyty nanomateriałów srebra można zaprojektować tak, aby uzyskać pożądany profil uwalniania jonów. Ta optymalizacja jest ważna, aby zminimalizować ilość wymaganego srebra, co prowadzi do bardziej opłacalnego produktu, który ma minimalny długoterminowy wpływ na środowisko.

Tagging and Targeting for Bio-imaging

Nanocząstki srebra absorbują i rozpraszają światło z niezwykłą wydajnością  i są wykorzystywane w aplikacjach do znakowania i obrazowania. Wysoki przekrój poprzeczny nanocząstek pozwala na obrazowanie pojedynczych nanocząstek srebra w mikroskopii ciemnego pola (Rysunek 5) lub hiperspektralnych systemach obrazowania.⁸ Poprzez przyłączenie biomolekuł, takich jak przeciwciała lub peptydy do powierzchni nanocząstek srebra, nanocząstki srebra mogą być ukierunkowane na określone komórki lub składniki komórkowe. Przyłączanie cząsteczek docelowych do powierzchni może odbywać się poprzez absorpcję na powierzchni nanocząstek lub poprzez kowalencyjne sprzęganie lub fizysorpcję.  Fizysorpcja jest zwykle wykonywana przy użyciu nanocząstek srebra z łatwo przemieszczalnym środkiem zamykającym, takim jak cytrynian. Dostosowując pH i stężenie soli, można uzyskać koniugaty nanocząstek srebra z przeciwciałami o wysokim powinowactwie i niskim niespecyficznym tle. Poprawę wydajności można osiągnąć poprzez kowalencyjne związanie przeciwciała z powierzchnią. Jednym z podejść kowalencyjnych jest funkcjonalizacja nanocząstek srebra za pomocą mieszanych monowarstw tiolowanych cząsteczek PEG, gdzie część tiolowanego PEG zawiera funkcjonalność kwasu karboksylowego, a pozostała część cząsteczek jest obojętna (zakończona metoksy). Stosując sprzężenie karbodiimidu etylo(dimetyloaminopropylu) (EDC), kwas karboksylowy może być następnie kowalencyjnie połączony z wolnymi aminami na przeciwciałach, uzyskując celowaną sondę nanocząstek srebra.

Rysunek 5. Obraz mikroskopii ciemnego pola nanosfer srebra o średnicy 60 nm.

Nanomedycyna i nanobezpieczeństwo

Wykorzystanie nanocząstek srebra w zastosowaniach in vitro oraz in vivo  gwałtownie rośnie. Oprócz znakowania fluorescencyjnego opartego na nanocząstkach srebra i nanotagów do spektroskopii ramanowskiej wzmocnionej powierzchniowo (SERS), inne zastosowania nanocząstek srebra obejmują ich wykorzystanie jako źródeł termicznych do hipertermii i modulowanego termicznie uwalniania leków z powłok powierzchniowych cząstek. Nanocząstki srebra mogą być również  wbudowane w konstrukcje rdzeń/otoczka. Amorficzna powłoka krzemionkowa równomiernie osadzona na rdzeniu nanocząstek srebra może mieć różne grupy funkcyjne sprzężone z powłoką, zapewniając środki do elektrostatycznych lub innych oddziaływań między powłoką a cząsteczką. Fluorofory, cząsteczki leków lub inne cząsteczki organiczne o wysokiej masie cząsteczkowej mogą być zintegrowane z powłoką w celu znakowania lub dostarczania leków w warunkach in vitro lub in vivo.

Wiele przyszłych biomedycznych zastosowań nanocząstek srebra będzie wymagać, aby interakcja nanocząstki z systemami biologicznymi była dobrze poznana. W zastosowaniach in vivo głównym wyzwaniem jest zaprojektowanie cząstek o długim czasie obiegu i niskiej toksyczności. Eksperymenty mające na celu optymalizację działania nanocząstek w systemach in vivo  są skomplikowane ze względu na złożoność zarówno samych nanocząstek, jak i ich środowiska. Biologiczny los i transport nanocząstek zależy nie tylko od pierwotnych właściwości cząstek (np. składu chemicznego rdzenia, rozmiaru, kształtu, krystaliczności, powierzchni i stanu agregacji), ale także od właściwości wtórnych, które zależą od interakcji nanocząstek z docelowymi układami biologicznymi (np, korona białkowa,  szybkość rozpuszczania, biodystrybucja).⁹ Eksperymenty przeprowadzone z zestawami precyzyjnie wytworzonych i dobrze scharakteryzowanych nanomateriałów o tylko  jednej zmodyfikowanej właściwości (np, chemia rdzenia, rozmiar, kształt lub powierzchnia)  zapewniają wgląd w odpowiedź biologiczną zróżnicowanej właściwości i  pomagają w określeniu optymalnych właściwości dla skutecznego działania.

Wnioski i perspektywy na przyszłość

Unikalne właściwości optyczne i szerokie właściwości przeciwdrobnoustrojowe nanocząstek srebra doprowadziły do szybkiego wzrostu zastosowania nanocząstek srebra w zastosowaniach biologicznych. Wysoki poziom kontroli, który jest dostępny do kontrolowania rozmiaru, kształtu i powierzchni nanocząstek srebra, zapewnia potężną bibliotekę nie tylko do generowania funkcjonalnych materiałów do zastosowań biologicznych, ale także do zrozumienia podstawowych mechanizmów transportu i interakcji nanocząstek w układach biologicznych. To zrozumienie, w połączeniu z budową bardziej złożonych wielofunkcyjnych nanokompozytów srebra, umożliwi następną generację sond, urządzeń i środków terapeutycznych opartych na nanocząstkach srebra.

1. Moskovits M. 1978. Surface roughness and the enhanced intensity of Raman scattering by molecules adsorbed on metals. The Journal of Chemical Physics. 69(9):4159-4161. https://doi.org/10.1063/1.437095

2. Kneipp K, Wang Y, Kneipp H, Perelman LT, Itzkan I, Dasari RR, Feld MS. Single Molecule Detection Using Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS). Phys. Rev. Lett.. 78(9):1667-1670. https://doi.org/10.1103/physrevlett.78.1667

3. Geddes CD, Lakowicz JR. 2002. 12(2):121-129. https://doi.org/10.1023/a:1016875709579

4. Rai M, Yadav A, Gade A. 2009. Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials. Biotechnology Advances. 27(1):76-83. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2008.09.002

5. Marambio-Jones C, Hoek EMV. 2010. A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment. J Nanopart Res. 12(5):1531-1551. https://doi.org/10.1007/s11051-010-9900-y

6. Sondi I, Salopek-Sondi B. 2004. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria. Journal of Colloid and Interface Science. 275(1):177-182. https://doi.org/10.1016/j.jcis.2004.02.012

7. Kim JS, Kuk E, Yu KN, Kim J, Park SJ, Lee HJ, Kim SH, Park YK, Park YH, Hwang C, et al. 2007. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 3(1):95-101. https://doi.org/10.1016/j.nano.2006.12.001

8. Carlson C, Hussain SM, Schrand AM, K. Braydich-Stolle L, Hess KL, Jones RL, Schlager JJ. 2008. Unique Cellular Interaction of Silver Nanoparticles: Size-Dependent Generation of Reactive Oxygen Species. J. Phys. Chem. B. 112(43):13608-13619. https://doi.org/10.1021/jp712087m

9. Powers KW, Palazuelos M, Moudgil BM, Roberts SM. 2007. Characterization of the size, shape, and state of dispersion of nanoparticles for toxicological studies. Nanotoxicology. 1(1):42-51. https://doi.org/10.1080/17435390701314902