Efektywny pomiar biomarkerów chorób sercowo-naczyniowych przy użyciu multipleksowych paneli opartych na kulkach magnetycznych

• Czym są biomarkery chorób sercowo-naczyniowych?
• CVD Multiplex Assays
• Przykład analizy biomarkerów CVD w próbkach surowicy i osocza
• Materiały i metody
  • Próbki
  • Analiza biomarkerów CVD
  • Analiza statystyczna
• Wyniki
• Podsumowanie
• Materials
  • Multiplex CVD Panels
  • Analiza polipoprotein
  • Related Instruments and Software

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD), w szczególności miażdżycowa choroba naczyń, są główną przyczyną śmiertelności na świecie. Szlaki zapalne odgrywają istotną rolę w inicjacji, utrzymaniu i progresji chorób naczyniowych, a istnieje silna korelacja między biomarkerami stanu zapalnego (takimi jak białka ostrej fazy) a rokowaniem w chorobie wieńcowej. Zobacz, w jaki sposób panele multipleksowe rozwijają badania nad CVD poprzez pomiar tych biomarkerów stanu zapalnego i CVD.

Czym są biomarkery chorób sercowo-naczyniowych?

Choroby sercowo-naczyniowe (CVD) są jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności. CVD obejmuje każdą chorobę, która wpływa na serce, tętnice lub żyły, ale częściej odnosi się do stanów miażdżycowych. CVD może również pokrywać się z zespołem metabolicznym.

Biomarkery chorób sercowo-naczyniowych obejmują fibrynogen, CRP, mieloperoksydazę i inne. Ponieważ naukowcy mają nadzieję na ułatwienie wczesnej diagnozy i interwencji, zainteresowanie pomiarem krążących biomarkerów CVD dramatycznie wzrosło w ciągu ostatniej dekady. Większość badań nad odkrywaniem biomarkerów CVD koncentrowała się na stanach związanych z blaszką miażdżycową. Takie podejście jest uzasadnione, ponieważ rozwój blaszki miażdżycowej jest przewlekły i postępujący, może być mierzony za pomocą rozpuszczalnych markerów i obejmuje większość przypadków CVD. Miażdżycowe CVD jest przewlekłym stanem zapalnym w ścianach tętnic, który prowadzi do powstawania blaszek miażdżycowych i kontynuuje kaskadę niedokrwienną.

Tabela 1 opisuje biomarkery CVD, które są związane z różnymi etapami CVD. Wiele analitów odnosi się do wielu etapów.

Testy multipleksowe CVD

Testy multipleksowe CVD, takie jak MILLIPLEX^®. umożliwiają naukowcom jednoczesną analizę wielu biomarkerów w pojedynczej małej objętości próbki surowicy/osocza lub próbek pochodzących z hodowli komórkowej/tkankowej. Testy multipleksowe MILLIPLEX^® CVD są dostępne dla próbek ludzkich, a także próbek z mysich i szczurzych modeli CVD.

Testy immunologiczne MILLIPLEX^® wykorzystują opartą na kulkach magnetycznych technologię Luminex^® xMAP^®. Testy mogą być odczytywane na dowolnym urządzeniu Luminex^®.

Przykład analizy biomarkerów CVD w próbkach surowicy i osocza

Po zweryfikowaniu tych testów MILLIPLEX^® pod kątem czułości, zakresu dynamicznego i zmienności, przetestowano próbki surowicy i osocza od pacjentów ze zdiagnozowaną chorobą CVD i bez niej, i stwierdzono, że wiele biomarkerów CVD było znacznie podwyższonych u pacjentów z CVD, co wskazuje na użyteczność paneli testowych w badaniach CVD.

Materiały i metody

Próbki

Próbki surowicy i osocza uzyskano od pacjentów pogotowia ratunkowego z diagnozą choroby sercowo-naczyniowej i bez niej. Dwadzieścia niedopasowanych próbek każdej matrycy uzyskano od pacjentów z CVD-ujemnymi i CVD-dodatnimi w tym samym szpitalu za pośrednictwem komercyjnego dostawcy. Podstawowe dane demograficzne (wiek, płeć i pochodzenie etniczne) zostały dostarczone dla każdej próbki (Tabela 2). Konkretne schorzenia, takie jak przewlekła niewydolność serca, choroba wieńcowa, przewlekła obturacyjna choroba płuc i nadciśnienie tętnicze zostały również dostarczone, jeśli były dostępne.

Analiza biomarkerów CVD

Wszystkie 80 próbek przeanalizowano przy użyciu czterech paneli kulek magnetycznych MILLIPLEX^® Human Cardiovascular Disease Magnetic Bead. Testy multipleksowe zostały wygenerowane przy użyciu typowego formatu testu kanapkowego z wykorzystaniem specyficznych dla analitu kulek sprzężonych z przeciwciałem wychwytującym i biotynylowanego przeciwciała wykrywającego. Testy zostały zweryfikowane przy użyciu oczyszczonych wzorców białkowych o znanych stężeniach.

Każdy panel jednocześnie mierzył wiele biomarkerów CVD, jak pokazano poniżej:

• Panel 1(dla czystych próbek surowicy i osocza): BNP, NT proBNP, CK-MB, CXCL6, CXCL16, ESM-1, FABP3, FABP4, PlGF, LIGHT, Oncostatin M, and Troponin I
• Panel 2 (dla 1:100 rozcieńczonych próbek surowicy i osocza): ADAMTS13, D-dimer, GDF15, mioglobina, sICAM-1, MPO, sP-selektyna, lipokalina-2/NGAL, sVCAM-1 i SAA
• Panel 3 (dla 1:40 000 rozcieńczonych próbek surowicy i osocza): A2M, CRP, Fetuina A, AGP, Fibrynogen, sL-Selektyna, SAP, Haptoglobina, PF4/CXCL4 i Adipsin
• Panel 4 (czyste próbki surowicy i osocza): sE-selektyna, folistatyna, sPECAM-1, pentraksyna-3, czynnik tkankowy, trombomodulina i troponina T

Analizy przeprowadzono zgodnie z odpowiednimi protokołami. Ogólnie rzecz biorąc, 96-dołkową płytkę testową przemywano 200 μL buforu testowego na studzienkę. Do każdej studzienki dodano 25 μL standardu/kontroli lub buforu, 25 μL matrycy (w razie potrzeby) lub próbki i 25 μL kulek. Płytki inkubowano przez noc z wytrząsaniem w temperaturze 4 °C. Płytkę testową przepłukano trzykrotnie buforem płuczącym. Do każdej studzienki dodano 50 μL przeciwciał wykrywających i inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Po dodaniu 50 μL streptawidyny-fykoerytryny (SAPE) do każdego dołka, płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut. Następnie płytkę testową przemyto trzykrotnie buforem płuczącym, a kulki ponownie zawieszono w płynie osłonowym. Wszystkie płytki analizowano przy użyciu urządzenia Luminex^® 200™.

Analiza statystyczna

Testy statystyczne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania MiniTab^® 16.1.0. Ze względu na małą liczebność próby i nienormalny rozkład danych, do analizy zmiennych ciągłych wykorzystano test U Manna-Whitneya, a do zmiennych kategorycznych test dokładny Fishera.

Wyniki

Krzywe standardowe dla każdego multipleksowanego panelu testowego wykazały około trzech rzędów wielkości w zakresie dynamicznym. Czułość testu dla większości analitów mieściła się w zakresie pg/ml, a współczynniki zmienności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej wynosiły odpowiednio <10% i <20%.

Porównanie testu z innymi dostępnymi na rynku testami

Stężenia wybranych analitów określone przy użyciu paneli MILLIPLEX^® CVD porównano ze stężeniami oznaczonymi przy użyciu innych dostępnych na rynku testów, takich jak testy ELISA i testy Luminex^® oparte na kulkach, i przedstawiono na Rysunku 1. Do każdego zestawu danych dopasowano linię regresji liniowej w celu oceny korelacji. We wszystkich przypadkach wartości R przekroczyły 0,8, co wskazuje na dobrą korelację między tymi multipleksowanymi panelami testów a innymi dostępnymi na rynku testami do ilościowego oznaczania biomarkerów.

Analityczna analiza multipleksowa CVD

Anality zostały wybrane z każdego panelu, który wykazał znaczące podwyższenie u pacjentów z CVD, a wykresy punktowe poszczególnych wartości zostały wykorzystane do wizualizacji zakresu stężeń analitów w poszczególnych próbkach zarówno dla grup CVD, jak i bez CVD. W panelu 1 biomarkery ESM-1, FABP3, PlGF i troponina I były podwyższone u pacjentów z CVD w porównaniu z pacjentami bez CVD (Rysunek 2).

Spośród biomarkerów w Panelu 2, ADAMTS13 i GDF-15 wykazały najbardziej zauważalny wzrost u większości pacjentów z CVD (Ryc. 3). 

C-Related Protein i Adipsin były znacząco podwyższone w próbkach osocza CVD analizowanych przy użyciu panelu 3 (Rysunek 4), a Follistatin, PECAM-1 i PTX3 były podwyższone w próbkach osocza CVD analizowanych przy użyciu panelu 4 (Rysunek 5).

Podsumowanie

Ponieważ CVD jest tak złożoną chorobą obejmującą wiele narządów i układów, multipleksowa analiza biomarkerów ma kluczowe znaczenie dla badań nad diagnostyką i leczeniem CVD. Te multipleksowe panele testowe oparte na kulkach magnetycznych umożliwiają dokładny, czuły, powtarzalny, jednoczesny pomiar 39 biomarkerów CVD w próbkach surowicy, osocza i hodowli tkankowej. W porównaniu z innymi komercyjnymi zestawami testowymi, te nowe panele multipleksowe wykazują dobre korelacje. Korzystając z tych paneli testowych ludzkich biomarkerów CVD, wykazano, że w porównaniu z próbkami od osób bez CVD, próbki pacjentów z CVD wykazały znacznie podwyższone poziomy wielu biomarkerów CVD, takich jak ESM-1, FABP3, PlGF, Troponina I, ADAMTS13, GDF-15, mioglobina, CRP, PECAM-1, PTX3 i inne.

Ze względu na zwiększoną łatwość użycia, wydajność i bezobsługową obsługę testów opartych na kulkach magnetycznych w porównaniu z tradycyjnymi metodami kwantyfikacji biomarkerów, te multipleksowe panele MILLIPLEX^® mogą potencjalnie zwiększyć wydajność odkrywania biomarkerów w badaniach nad CVD.

Materials

.Panele multipleksowe CVD

Zapoznaj się z naszymi panelami multipleksowymi CVD MILLIPLEX^®, które zostały wykorzystane w tych badaniach, a także z innymi produktami. MILLIPLEX^® CVD Panel 3 może mierzyć białka ostrej fazy. Białka ostrej fazy są wytwarzane w wątrobie w odpowiedzi na cytokiny prozapalne. Stężenie tych białek w surowicy zmienia się znacząco w odpowiedzi na stan zapalny, a stan zapalny o niskim stopniu nasilenia jest skorelowany z chorobą sercowo-naczyniową.

Tylko do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Apolipoprotein Analysis

Apolipoproteiny, takie jak Apo AI, Apo AII i Apo B, wiążą się z lipidami i transportują je przez krwiobieg. Ich poziom może korelować z ryzykiem wystąpienia choroby wieńcowej.

Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.

Powiązane instrumenty i oprogramowanie

Znajdź poniżej instrumenty i oprogramowanie współpracujące z testami MILLIPLEX^®.

Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.